Julius von Sachs, dem Begründer der Pflanzenphysiologie, zum 100. Todestag gewidmet.

Ein Teil seines Lebenswerkes befasste sich mit der Bewegung im Pflanzenreich.

Da Pflanzen ihren natürlichen Standort nicht verlassen können, überleben sie nur, wenn sie sich an die Umwelt mit ihren unvorhersehbaren Veränderungen präziser anpassen. Im Gewächshaus lässt sich mithilfe einer Gaswechselapparatur

der Zusammenhang zwischen Fotosynthese und Wasserhaushalt der Pflanze untersuchen. Es werden die Aufnahme von Kohlendioxid und der Verlust des Blattes am Wasserdampf gemessen und am Bildschirm verfolgt.

Dazu wird ein Blatt in eine Kühwette eingespannt. Ein definiertes Luftgemisch, dessen CO2-Gehalt und Luftfeuchte exakt eingestellt sind, streicht über das Blatt. Durch kontinuierliche Bestimmung der Gaszusammensetzung wird die fotosynthetische CO2-Aufnahme

und der transpirationsbedingte Wasserdampfverlust des Blattes erfasst. Im Laufe eines Tages werden CO2-Aufnahme und Wasserdampfabgabe gegenübergestellt.

Mit Sonnenaufgang setzt die CO2-Fixierung ein, erreicht oft zur Mittagszeit ihre höchste Rate, um im Verlauf der Dämmerung wieder abzunehmen. Anstieg und Abfall des Blattwasserverlustes begleiten diesen Prozess. Der Gewinn von einem Molekül CO2 kostet den Verlust von etwa 600 Molekülen Wasser.

Diesem Dilemma ist die Pflanze jedoch nicht hilflos ausgesetzt. Denn sie ist in der Lage, die CO2-Aufnahme und den Blattwasserverlust über regulierbare Poren der Wasserversorgung aus dem Boden anzupassen.

Im Blatt kontrolliert allein das äußere Abschlussgewebe, die Epidermis, den Gaswechsel zwischen Interzellularräumen und Atmosphäre. In der unteren Epidermis sind mikroskopisch kleine Poren, die Stomatat zu erkennen.

Das offene Stoma vermittelt den Einstrom von CO2 sowie den Ausstrom von Wasserdampf.

Die Epidermis, die aufgrund eines Wachsüberzugs selbst nahezu gasundurchlässig ist, wird nun für die Betrachtung unter dem Mikroskop präpariert. Durch Volumenzunahme dehnen sich die Schließzellen in ihrer Längsrichtung aus.

Das Stoma öffnet sich. Die molekularen Mechanismen, die der Stoma-Bewegung zugrunde liegen, werden nun veranschaulicht. Die Stoma-Öffnung ist abhängig von Ionen- und Wasseraufnahme aus dem Extra-Zellularraum, sowie von der Bereitstellung von Malat-Ionen aus dem Starkeabbau der Chloroplasten.

Kalium und Chlorid werden in die beiden Schließzellen aufgenommen und das Malat aus den Chloroplasten in die Vakuole transportiert. Der Eintransport und die Synthese dieser Ionen erzeugen einen osmotischen Gradienten,

dem der Wassereinstrom folgt. Durch Einstrom der osmotisch aktiven Ionen erhöht sich nach und nach der Turgur der Schließzellen, sodass sich die beiden Zellen voneinander abstoßen.

Beim Schließen kehrt sich der Vorgang um. Durch Entlassen von Kaliumsalzen und Wasser verringern die Schließzellen ihr Volumen. An der Regulation des Volumens und damit der Stoma-Weite sind Kalium-Transportproteine in der Plasma-Membran der Schließzellen entscheidend beteiligt.

Um die Aktivität dieser Transportproteine in einzelnen Schließzellen messen zu können, werden die Epidermisstreifen isoliert und anschließend mit zellwandabbauenden Enzymen behandelt.

Während einer schonenden Verdauung der Zellwand

beobachtet man innerhalb von wenigen Stunden eine Umgestaltung des Zytoskeletts. Gleichzeitig beginnen die Schließzellen, sich aus dem Zellverband zu lösen. Zellorganellen wie Kern, Vakuole und Chloroplasten bleiben dabei intakt

und werden durch die Zytoplasmaströmung umorientiert. Mit fortschreitendem Abbau der Zellwand nähert sich die Gestalt der Zellen der Kugelform. Protoplasten entstehen.

Nun ist die Plasma-Membran einer biophysikalischen Analyse mit der Patch-Clamp-Technik frei zugänglich. Einer Technik, mit der sich die Aktivität einzelner Transportproteine verfolgen lässt. Hierzu werden die Protoplasten mit isotonischer Kaliumsalzlösung umspült.

Taucht man eine Referenz und eine Messelektrode in die Elektrolytlösung ein, setzt sie auf den Protoplasten auf und saugt leicht an. So wird eine omega-förmige Ausstülpung der Plasma-Membran in die Messelektrode gezogen. Vergrößert man diesen Membranausschnitt über den Bereich der licht- und elektronenmikroskopischen Auflösung hinaus,

so lässt sich im Modell der molekulare Aufbau der Einheitsmembran darstellen. In die Phospholipid-Doppelschicht eingebettet liegt das Transportprotein, der Kaliumkanal. Der geschlossene Kanal ist für Kalium-Ionen undurchlässig.

Beim schlagartigen Öffnen des Kanals leitet er Kalium-Ionen durch die Membranbarriere ins Zellinnere. Der Durchtritt von positiv geladenen Ionen erzeugt einen elektrischen Strom.

Schließt der Kanal, versiegt der Strom augenblicklich. Bisher sind diese Schaltvorgänge verlangsamt dargestellt. Nun werden sie stufenweise an den realen Ablauf herangeführt, hier immer an der gleichen Spur gezeigt.

Die jeweilige Öffnungsdauer reicht von wenigen bis zu 10 bis 30 Millisekunden. In einer Millisekunde leitet der Kanal circa 10.000 Kalium-Ionen ins Innere der Schließzelle. Somit wird das Öffnen und Schließen des Kanals von charakteristischen Stromfluktuationen begleitet und dadurch messbar.

Die Auflösung von Ionenkanalströmen im Picoamperbereich ist nur mit Hilfe der Patchclamp-Technik möglich. Diese biophysikalische Methode erfordert einen hohen messtechnischen Aufwand,

einen extrem rauscharmen Verstärker und schnelle computergestützte Analysen. Im Folgenden sollen die Schritte, die zur Vorbereitung eines Patchclamp-Experiments nötig sind, im Einzelnen dargestellt werden.

In einem ersten Schritt werden spezielle Mikroelektroden hergestellt. Dazu benutzt man Glaskapillaren von circa einem Millimeter Durchmesser, die im Innern einer Heizwendel zentriert werden.

Mittels der Heizwendel schmilzt die Kapillare und ein Gewicht zieht sie zu einer feinen Spitze aus. Die Öffnung hat jetzt nur noch einen Innendurchmesser von etwa einem Mikrometer. Es folgt eine Optimierung der Kapillare durch Beschichten und Anschmelzen unter dem Mikroskop.

Die Ränder der offenen Spitze glätten sich in der Nähe eines glühenden Filaments. Dies gewährleistet im Experiment einen engen Kontakt zwischen Glasoberfläche und Zellmembran. Durch Beschichten der kapillaren Spitze mit einem Kunststoff ist die Eigenleitfähigkeit des Glases so stark herabgesetzt,

dass die elektrischen Eigenschaften der Membran messbar werden. Im nächsten Schritt wird die Kapillarspitze für die Messung mit einem isotonischen Elektrolyten gefüllt.

Dieser enthält im Wesentlichen Kaliumionen. Durch Einführen einer Silberelektrode ist der Kontakt mit dem Elektrolyten in der Kapillare hergestellt. Die nun funktionsbereite Messelektrode bildet zusammen mit der Referenzelektrode

und dem Schließzellprotoplasten in der Messküvette einen geschlossenen Stromkreis. Die Protoplasten befinden sich in der Objektebene des Mikroskops. Mithilfe von Mikromanipulatoren wird die Messelektrode vorsichtig an den Protoplasten herangeführt.

Der Kontakt zwischen Messelektrode und Plasmamembran lässt sich durch leichtes Ansaugen verstärken. Hierbei nimmt der elektrische Widerstand kontinuierlich zu. Ein akustisches Signal unterstreicht dies.

Wenn die Membran die Spitze der Mikroelektrode vollständig abdichtet, wird der Stromfluss unterbunden, weil sich zwischen Mess- und Referenzelektrode ein Widerstand im Gigaohmbereich aufbaut.

Der gemessene Widerstand ist im Wesentlichen der des Membranfleckens, des Patch. Der Widerstand der großen Restfläche hingegen ist vernachlässigbar, da der Widerstand reziprok zur Fläche eingeht. Aufgrund des engen mechanischen Kontakts zwischen Membran und Glaswand lässt sich der Membranfleck unversehrt von der Zelle ablösen.

Dadurch ist die zelluläre Seite, die Membraninnenseite, experimentell zugänglich. Jetzt lässt sich die Potentialdifferenz zwischen Membraninnen- und Außenseite das sogenannte Membranpotential gezielt einstellen.

Der elektrische Strom durch den Membranfleck wird als Ersatzschaltbild dargestellt. Die Membran stellt den ungehemmten Kaliumfluss und damit dem elektrischen Strom I den Widerstand R entgegen.

Aufgrund der Spannungsunterschiede zwischen U0 und UM fließt ein elektrischer Strom I, der proportional dem Spannungsunterschied zwischen U0 und UM und dem reziproken Widerstand R ist.

Verstärkt man jedoch das Stromsignal zehntausendfach, so zeigen Fluktuationen im Picoamperbereich, das Öffnen und Schließen einzelner Kaliumkanäle des Schließzellprotoplasten. Der Fluss durch einen offenen Kanal, das heißt die Stromamplitude, wird vom Membranpotential bestimmt.

Je negativer das Potential der Membraninnenseite wird, desto stärker ist die treibende Kraft für den Einstrom des positiv geladenen Kaliumions. Der Strom nimmt zu. In einem Koordinatensystem lässt sich die Spannungsabhängigkeit des Kaliumstroms durch den offenen Kanal darstellen.

Hierfür ordnet man die Stromamplitude dem jeweiligen Membranpotential zu.

Der Strom durch den offenen Kanal ist eine Funktion der angelegten Spannung und der Kaliumleitfähigkeit des Kanals G. In Analogie zu einem ohmschen Widerstand erhält man aus der linearen Abhängigkeit des Stroms von der angelegten Spannung die Kaliumleitfähigkeit G des Kanalproteins.

Im Vergleich zu Kaliumkanälen in Nervenzellen haben die Schließzellkanäle mit 5 bis 8 Pikosimens nur ca. ein Drittel der Leitfähigkeit.

Innerhalb einer halben Stunde transportieren einige 100 bis 1000 Kanäle so viel Kalium in die Schließzellen hinein, dass Kaliumsalze akkumulieren. Das Pulsieren des Kaliumstroms in der Membran lässt sich also auf das Öffnen und Schließen von Kaliumkanälen zurückführen.

Dieses Prinzip des Mikroventils wird nicht nur bei der Stoma-Bewegung genutzt, sondern stellt einen generellen Mechanismus für den Kaliumtransport in Pflanzen sowie in allen anderen Lebewesen dar.

Im Zentrum der Forschungsaktivitäten von Hubert Ziegler stehen Stoffflüsse in Pflanzen, ihre Kanalisation, Regulation und ihre Nutzung.

Für Pflanzen ist Kalium einer der wichtigsten Nährstoffe, der aus dem Boden aufgenommen wird und für Wachstum, Differenzierung und Bewegung zur Verfügung steht.

Kaliumionen sind maßgeblich am Aufbau des Turgurs und damit der Zellstreckung beteiligt. Nach Aufnahme in die Wurzel dehnt sich die Zellwand und das Zellvolumen nimmt zu.

Internodien strecken sich als Folge der zunehmenden Anreicherung von Kaliumionen. Blätter entfalten. Turgur-getriebene Mikroventile, die Stomata, vermitteln den Gasaustausch zwischen Blatt und Atmosphäre.

Ähnlich wie in die Zellen der Wurzel des Sprosses oder der Blätter, erfolgt die Kaliumaufnahme in die Schließzellen maßgeblich über Kaliumkanäle. Die Strategien und Techniken zur molekularen Analyse eines pflanzlichen Kaliumkanals werden hier exemplarisch für die Schließzellen von Viziafaba vorgestellt.

Am Laserscanning-Mikroskop lässt sich mithilfe eines Fluoreszenzfarbstoffes der Zellkern deutlich sichtbar machen. Er speichert den genetischen Bauplan für einen Kaliumkanal in Form von Nukleinsäuresequenzen, der DNA.

Nach Aktivieren des entsprechenden Gens wird dieser Bauplan in die Messenger RNA umgeschrieben und aus dem Kern geschleust. Diesen Kopiervorgang bezeichnet man als Transkription. Auf sie folgt die Translation. Im Zytoplasma wird die frisch transkribierte mRNA in die entsprechende Aminosäuresequenz umgeschrieben.

Das Protein des Kaliumkanals entsteht und wird in die Plasmamembran eingebaut. Der Bauplan von Kaliumkanälen ist auf die Rolle zugeschnitten, welche er für einen Zelltyp, ein Gewebe oder auch für eine Entwicklungsphase spielt.

Um das Gen für einen Schließzell-Kaliumkanal zu isolieren, wird zunächst die stommerreiche untere Epidermis vom Blatt abgezogen und in flüssigem Stickstoff gesammelt.

Dadurch erhält man ein Bild, der im Moment des Einfrierens aktiven Gene, welche durch die mRNA repräsentiert sind.

Die Zellwände von Schließzellen sind mechanisch stabil und halten selbst einem Turgordruck von bis zu 10 Bar stand. Durch Mörsern brechen sie auf. In einem mehrstufigen Prozess wird nun die mRNA isoliert und aufgereinigt.

Das Zelllysat wird in ein Reaktionsgefäß aufgenommen und in einen denaturierenden Puffer überführt.

Hierdurch werden die RNA-abbauenden Enzyme inaktiviert. Die Zellwände lassen sich im ersten Aufreinigungsschritt von den löslichen Zellbestandteilen durch Zentrifugieren abtrennen. Unter dem Abzug wird der wässrige Überstand, der neben RNA auch DNA und Proteine enthält, mit einem Phenolchloroform-Gemisch versetzt.

Danach durchmischt und erneut zentrifugiert.

Durch diese organische Extraktion trennen sich die Nukleinsäuren von den Proteinen ab. In der unteren organischen Phase sammeln sich vornehmlich Proteine an. In der Interphase die DNA.

Im wässrigen Überstand reichert sich die GesamtRNA an. Der Anteil der mRNA an dieser Fraktion beträgt nur ca. ein bis zwei Prozent. Der Überstand wird abgenommen und anschließend mit Natriumacetat versetzt.

In Gegenwert von Natriumacetat und Isopropanol fällt die nun unlösliche RNA aus.

Durch Zentrifugation sammelt sich die GesamtRNA am Boden des Reaktionsgefäßes. Hiernach wird die in Lösung gebrachte GesamtRNA einer Affinitätsreinigung unterzogen.

Die GesamtRNA enthält mRNA, die sich durch eine Kette von Adeninnukleotiden an ihrem Dreistrichende auszeichnet. Darin unterscheidet sie sich von der ribosomalen RNA und der TransferRNA.

Nach Zugabe von magnetischen Kügelchen, die mit Polytymidinketten beschichtet sind, knüpfen die Polyadeninketten der mRNA mit den Polytymidinketten der magnetischen Kügelchen Wasserstoffbrücken.

Durch einen starken Magneten lässt sich dieser Komplex nun an die Seitenwand des Reaktionsgefäßes ziehen und dort festhalten.

Damit ist die mRNA von der übrigen RNA abgetrennt. Im Labor erfolgt die Isolierung der mRNA von der GesamtRNA in Reaktionsgefäßen, auf die ein starker Magnet einwirkt.

Nicht gebundene RNA wird abpippetiert und verworfen.

Durch Zugabe eines Illusionspuffers lässt sich die mRNA aus dem Komplex mit den Magnetkügelchen freisetzen und danach elektrophoretisch nach ihrer Größe und Ladung auftrennen.

Hierzu benutzt man ein Agarosegel. Die Zähne eines Kammes sparen Einfülltaschen für die Beladung des Gels mit dem mRNA-Gemisch aus. Inzwischen ist die RNA mit den beiden Farbstoffen Xylenecyanol und Bromphenolblau versetzt worden.

Die so vorbereitete mRNA wird in die Taschen des Agarosegels pippetiert. Aufgrund der hohen Dichte des glycerinhaltigen Beladungspuffers sinken die RNA-Proben auf den Boden der Einfülltaschen. Zum Größenvergleich sind die GesamtRNA sowie ein Längenstandard aufgetragen worden.

Durch Anlegen einer konstanten Spannung startet die Elektrophorese. Die beiden Farbstoffe zeigen die fortschreitende Auftrennung der zunächst unsichtbaren RNA an. Im elektrischen Feld trennen sich die unterschiedlich langen und damit unterschiedlich mobilen RNAs ähnlich wie die Farbstoffe auf.

Nach Inkubation in Etidium bromid fluoresziert die RNA im UV-Licht. Ihre Größenverteilung wird anhand eines mitlaufenden Standards deutlich. Dieser umfasst Banden zwischen 9000 und 200 Basen.

Die GesamtRNA ist durch zwei deutlich hervortretende Banden gekennzeichnet. Die ribosomalen 28S und 18S-RNA-Banden. Die mRNA fluoresziert diffus in einem Größenbereich von ca. 400 bis 4000 Basen.

Die Entschlüsselung des Kaliumkanalgens erfolgt auf der Ebene der cDNA, welche eine Kopie der mRNA darstellt.

Die zu tausenden gleichzeitig exprimierten mRNAs werden daher in einer cDNA-Bibliothek gespeichert. Die Fraktion der mRNA codiert entsprechend der großen Zahl exprimierter Gene Proteine unterschiedlicher Größe und Funktion.

Um die cDNA-Bibliothek herzustellen, werden im Labor zahlreiche Einzelschritte durchlaufen.

Diese werden nun exemplarisch an einem mRNA-Molekül veranschaulicht. Die Herstellung der cDNA-Bibliothek beginnt mit dem Kopieren der mRNA in die entsprechende cDNA.

Im ersten Schritt binden Polytymidinprimer an die Polyadeninenten der mRNA, indem sich zwischen ihnen Wasserstoffbrücken bilden. Symbole kennzeichnen die Nukleotide.

Die mRNA besteht aus den Nukleotiden Cytosin, Uracil, Adenin und Guanin. Am Polytyprimer setzt die Reverse-Transkriptase an.

Sie synthetisiert aus den in der Lösung befindlichen Nukleotiden den korrespondierenden cDNA-Strang. Es resultiert ein Hybrid aus RNA und DNA. Die Erst-Strang-Synthese ist abgeschlossen.

Für die Zweit-Strang-Synthese benötigt man zunächst RNA-SEH. Sie baut nun spezifisch den mRNA-Leitstrang ab.

Als nächstes wird die DNA-Polymerase eingesetzt. Die durch die RNA-SEH generierten Lücken werden durch die DNA-Polymerase aufgefüllt.

Die beteiligten Enzyme arbeiten Hand in Hand.

Jetzt kommt eine Ligase ins Spiel. Die Ligase verknüpft die noch offenen Bruchstellen des nun durchgehenden zweiten DNA-Stranges.

Alle diese Enzymreaktionen, die nacheinander vorgestellt worden sind, laufen unter Temperaturkontrolle im Thermoblock gleichzeitig ab. Nach Aufreinigen der nun doppelsträngigen DNA wird wiederum eine Ligase benötigt. Diese bestückt die Enden der cDNA mit Adaptoren und bereitet die DNA so für die Klonierung vor.

Dadurch erhält die doppelsträngige DNA an ihren Enden jeweils überhängende Einzelstrangbereiche.

In einem letzten Schritt sollen die jeweiligen cDNA-Stränge in Plasmide eingeschleust werden, welche somit als Vektoren dienen.

Die Plasmide werden zuvor mit einem geeigneten Restriktionsenzym für die Klonierung der cDNA vorbereitet. Die freien Enden der Plasmide passen nun genau auf die Enden der cDNA. Die Gasen verknüpfen die Enden miteinander.

Nach Ablauf der Enzymreaktionen ist jede mRNA jetzt in Form ihrer cDNA in der Plasmid-cDNA-Bibliothek mindestens einmal vertreten. Es geht nun darum, das Kaliumkanalgen anhand seiner Funktion aus dieser cDNA-Bibliothek herauszufiltern.

Hierzu werden Hefezellen mit den Plasmiden transformiert. Im ersten Schritt versetzt man eine Hefezellensuspension mit dem cDNA-Plasmid-Gemisch. Zur Transformation wird das Gemisch nun in eine Kuvette übertragen.

Die Bäckerhefe ist zum Herausfiltern des Kaliumkanalgens geeignet, weil ihr Wachstum ebenso wie das der Pflanzen von der Fähigkeit abhängt, Kaliumionen aufzunehmen.

Der Vorgang der Transformation vollzieht sich in einem Elektroporator.

Über zwei Kondensatorplatten an den beiden seitlichen Kuvettenwänden wird ein elektrisches Feld angelegt, um die Aufnahme der Plasmide in die Hefezellen vorzubereiten. Durch einen kurzen Spannungspuls bilden sich Poren von wenigen Nanometern Durchmesser in der Plasmamembran der Hefezellen.

Sie ermöglichen den Eintritt der Plasmide in die Hefen. Unter den Plasmiden befinden sich nun einige, die das Kaliumkanalgen tragen.

Die transformierten Hefezellen werden auf ein Selektionsmedium überführt. Hat man mit der Schließzellen-C-DNA-Bibliothek eine Hefemutante transformiert, welche die Fähigkeit Kalium aufzunehmen eingebüßt hat,

so wachsen nur die Hefezellen heran, auf die ein pflanzliches Kaliumkanalgen übertragen wurde.

Im Zuge eines Screenings werden die transformierten Hefezellen auf ein Kaliummangelmedium ausgestrichen und einer Funktionsanalyse unterworfen. Hierzu wird das Wachstum der Hefen über mehrere Tage verfolgt.

Ein mehrstufiges Screening selektiert letztendlich solche Hefen, die auf Nährböden mit niedrigem Kaliumgehalt ein pflanzliches Kaliumkanalgen funktionell exprimieren. Eine solche Hefe wächst, teilt sich und bildet eine Kolonie, die aus mehreren Millionen Zellen besteht.

Wachsende Kolonien werden vereinzelt und erneut in einem Brutschrank für zwei bis drei Tage inkubiert.

Am Ende des Screenings trägt jede Hefekolonie, das heißt jeder Klon, ein Kaliumkanalgen. Für die nachfolgende Sequenzierung benötigt man große Plasmidmengen. Deshalb werden einzelne Kolonien von der Agarplatte in ein Flüssigmedium überimpft.

Um die Plasmidmenge noch weiter zu steigern, werden in einem Zwischenschritt die Plasmide auf Escherichia coli übertragen. Unter optimalem Nährstoffangebot wächst der E. coli-Klon in einem Schüttelincubator zu einer dichten Suspension heran.

Eine Voraussetzung, um die kaliumkanaltragenden Plasmide zu isolieren. Die Sequenzierung des Kaliumkanalgens basiert auf der Kettenabbruchmethode nach Sänger.

Jede der im Vorfeld erfolgten Sequenzierungsreaktionen endet mit einer modifizierten Form der Basen A, C, G oder T. Das resultierende Gemisch aus unterschiedlich langen DNA-Ketten

wird auf ein hochauflösendes Polyakrylamidgel eines automatischen Sequenzierers aufgetragen. Im Sequenzierer lassen sich fluoreszenzmarkierte DNA-Fragmente auftrennen, die sich in ihrer Länge jeweils nur um ein Nukleotid unterscheiden.

Ein Laser rastert dieses Gel und damit die einzelnen DNA-Fragmente ab und bestimmt so die Abfolge der Nukleinsäuren im Kaliumkanalgen. Überlappende DNA-Sequenzen werden vom Computer zusammengesetzt und die Primärstruktur des Kaliumkanalgens der Schließzelle entschlüsselt.

Der Computer digitalisiert die vom Laser erfassten DNA-Muster. Hierdurch wird die automatische Bestimmung der Basenabfolge ermöglicht.

In einem Durchgang wird die Reihenfolge der Basen entlang der A-, C-, G- und T-Spur gelesen. Mit jeder Sequenzierung wächst die Nukleotidkette des Kaliumkanalgens kontinuierlich an, bis letztendlich die vollständige Sequenz vorliegt.

Mit der Nukleotidfolge ist der Bauplan des Kanalgens bestimmt. Dieses Kaliumkanalgen ist aus Schließzellen mRNA isoliert und durch Hefewachstum identifiziert worden. Es wird im Kern der Schließzelle exprimiert.

Nach Umschreiben in die mRNA wird diese in das Zytosol geschleust. Am endoplasmatischen Reticulum übersetzen Ribosomen die Ribonukleinsäuresequenz in eine Aminosäuresequenz.

Die Untereinheiten des Kaliumkanals werden in die Plasmamembran eingebaut. Eine Schließzelle ist somit in der Lage, Kaliumionen aufzunehmen und durch sie die Stomabewegung anzutreiben. Dieser Vorgang ist das Ergebnis der Änderung von Kanalaktivität und Kanaldichte.

Somit steuert die Aktivität von Kaliumkanalgenen und von anderen zellspezifischen Genen Bewegung, Wachstum und Differenzierung von Pflanzen, sowie ihrer Anpassung an ständig wechselnde Umweltbedingungen.

Mit der Entschlüsselung des Bauplans pflanzlicher Gene wird die Untersuchung der molekularen Regulationsmechanismen dieser Vorgänge möglich. Die moderne Pflanzenphysiologie leistet einen maßgeblichen Beitrag dazu.

Erwin Neher und Klaus Raschke haben Voraussetzungen geschaffen, biologische Vorgänge vom Phänomen zum Molekül zu verfolgen.

Im Gegensatz zum spontanen Wachstum von Kristallen werden Wachstum, Bewegung und Differenzierung lebender Zellen durch Eiweißmoleküle vermittelt.

In Schließzellen wurden die ersten pflanzlichen Kaliumkanäle analysiert und kloniert. Ionenkanäle, Proteine der Plasmamembran, vermitteln den Stoff- und Informationsaustausch zwischen der Zelle und ihrer Umgebung. Der molekulare Bauplan und damit die Struktur dieser Proteine ist im Zellkern gespeichert.

Nach der Entschlüsselung der Genstruktur der ersten Kaliumkanäle fördern breit angelegte Genom-Sequenzierungsprogramme stündlich Sequenzen neuer Kanalproteine zu Tage. Möglich wurde dies durch eine neue Generation von automatischen Sequenzierern und Hochleistungskomputern.

Es lässt sich ein Stammbaum von Kaliumkanälen aufstellen, welcher Bakterien und Pilze, Pflanzen und sogar Menschen umschließt.

Der Abstand der Äste entspricht dem genetischen Abstand der Kaliumkanäle voneinander, das heißt versinnbildlicht ihren Verwandtschaftsgrad innerhalb dieser drei Organismengruppen. Vergleicht man die Aminosäureabfolge all dieser Kanalproteine, so wechseln sich

Variable mit Homologenbereichen ab, letztere als vertikale Balken zu erkennen. Ein Merkmal teilen alle Kaliumkanäle, unabhängig vom Organismus. Sie sind in der Lage, unter annähernd gleichgroßen Cationen selektiv das Kaliumion zu transportieren.

Dieser kleinste gemeinsame Nenner ist durch die Aminosäureabfolge Glycine-Tyrosin-Glycine repräsentiert, welche bereits in Kaliumkanälen von Bakterien und sogar in Viren gefunden wird. In diesem und angrenzenden Bereichen sollen nun Aminosäuren ausgetauscht werden, um deren Funktion im Schließzellkaliumkanal zu prüfen.

Der Austausch einzelner Aminosäuren, zum Beispiel einer geladenen gegen eine

ungeladene oder einer hydrophilen gegen eine hydrophobe, nennt man gezielte Mutagenese. Sie erfolgt auf der Ebene der DNA. Ein Plasmid, welches die Kaliumkanal C-DNA enthält, dient als Matrize für die Polymerase-Kettenreaktion.

Die molekularen Einzelschritte eines Mutagenesezyklus werden nun veranschaulicht. In einem ersten Schritt wird die Plasmid-DNA denaturiert.

Die Wasserstoffbrücken lösen sich, und die DNA-Doppelstränge weichen auseinander. Nach Absinken der Reaktionstemperatur lagert sich nun ein Oligonukleotid, welches die gewünschte Mutation trägt, an die Einzelstrang-DNA an. Das freie Dreistrichende des Oligonukleotids dient als Primer für eine DNA-Polymerase, welche nun den zirkulären DNA-Leitstrang kopiert.

Die hierdurch herbeigeführte Kettenverlängerung nennt man Elongation.

Ein Plasmidhybrid aus nicht mutierter und mutierter DNA entsteht. Damit ist der erste Mutagenesezyklus abgeschlossen. Der zweite Zyklus beginnt mit dem Aufschmelzen dieses Hybrides.

Ein zweiter, nun komplementärer Primer lagert sich im Zuge des Anilings an den mutierten Einzelstrang an. Er passt perfekt.

Während der Elongationsreaktion verlängert abermals die Polymerase das freie Dreistrichende des Primers. Am Ende des zweiten Mutagenesezyklus steht eine mutierte doppelstringige Kaliumkanal-C-DNA.

Diese Vorgänge werden nun vielfach wiederholt und damit die selektiv mutierte Kaliumkanal-C-DNA amplifiziert. Diese wird in CopyRNA umgeschrieben und steht nun für eine funktionelle Analyse zur Verfügung.

Um die Funktion von Transportproteinen zu überprüfen, verwendet man ein Zellsystem, das selbst keine oder nur wenige Ionenkanäle besitzt.

Hierfür haben sich die Oozyten des südafrikanischen Krallenfrosches Xenopus levis etabliert. Einzelne Eier werden auf ihre Vitalität hingeprüft und für die Injektion mit CRNA, die das mutierte Kaliumkanalgen enthält, vorbereitet.

Mithilfe von Mikromanipulatoren und einer automatischen Injektionseinrichtung wird die Kapillare eingestochen und die CRNA in die Oozyten gespritzt.

Es entsteht somit eine Population von Oozyten, die das mutierte Kaliumkanalgen enthält. In eine zweite Serie von Oozyten wird das unveränderte Kaliumkanalgen des Wildtyps injiziert. Beide Populationen können so bei der nachfolgenden Analyse miteinander verglichen werden.

Im Zellinnern wird die Kaliumkanal mRNA von Ribosomen erkannt und in Protein-Undereinheiten umgeschrieben. Diese lagern sich zusammen und fusionieren mit der Plasmamembran der Oozyte.

Bereits ein bis zwei Tage nach Injektion der Kaliumkanal-CRNA sind die elektrischen Eigenschaften der Oozytenmembran maßgeblich von Kaliumkanälen bestimmt. Oozyten werden in die Bohrung einer Durchflussküvette eingebracht und von Kaliumlösung umspült.

Mithilfe der zwei-Elektroden-Spannungsklemmentechnik können Kaliumströme durch viele Hunderttausende gleichzeitig exprimierter Kanäle sichtbar gemacht werden. Hierzu sticht man vorsichtig eine Spannungs- sowie eine Stromelektrode in die Oozyte ein. Dies geschieht mit Hilfe eines Mikromanipulators.

Die Spannungselektrode links misst das Membranpotential. Die Stromelektrode rechts speist genau so viel Strom ein, wie zur Aufrechterhaltung des jeweiligen Testpotentials nötig ist. Der membranpotentialabhängige Kaliumstrom wird von einem Verstärker erfasst und aufgezeichnet.

Die Steuerung des Messprogramms und die Auswertung der Daten übernimmt ein Computer. Nun wird der Kaliumstrom in die Oozyte verfolgt, hier am Beispiel des Wildtypkanals.

Wenn das Membranpotential schrittweise zu negativen Werten verändert wird, baut sich für den hier ausgewählten Kanal ein zeitabhängiger Kaliumstrom auf. Ersetzt man nun das Kalium der Messlösung durch Natrium, so fließen selbst bei starker Polarisierung der Membran, hier –160 mV, keine Ströme.

Das heißt, der Kaliumkanal ist für Natrium-Ionen undurchlässig.

Wird dieses Experiment nun mit verschiedenen Kanalmutanten wiederholt, fällt auf, dass einige von ihnen auch in reiner Natriumlösung einen Ionenstrom vermitteln. Das Selektivitätsfilter ist quasi undicht und lässt neben Kalium-Ionen auch Natrium-Ionen durch.

Dieses Experiment zeigt, dass ein ganz eng umgrenzter Bereich das Selektivitätsfilter der Ionen leitenden Pore formt. Jetzt gilt es, die dreidimensionale Struktur des Kanalproteins durch Kristallisation aufzuklären.

Mit Mikroorganismen, die im Fermenter zu einer dichten Suspension heranwachsen, lässt sich das gewünschte Protein millionenfach anreichern. Hier ein Membranprotein des Purpurbakteriums Rhodobacter spheroides.

Im ersten Schritt sind die Bakterien in einer Durchflusszentrifuge sedimentiert und somit vom umgebenden Nährmedium abgetrennt worden. Auf der Kunststoffmembran hat sich während des Zentrifugierens ein mehrere Millimeter dickes Bakterien-Sediment gebildet.

Die Dichte der Bakterien und damit des zu isolierenden Membranproteins hat sich im Sediment extrem vervielfacht. Dieses Zellkonzentrat wird mit einem Spatel in ein Becherglas überführt und gewogen.

Für die nachfolgende Isolierung und Kristallisation des Membranproteins benötigt man mehrere Gramm Sediment.

Die anschließenden Schritte finden im Kühlraum statt, um zu verhindern, dass die höchstlabilen Membranproteine zerfallen. Diese gilt es jetzt durch chromatographische Verfahren voneinander abzutrennen.

Nach Auflösen der Zellmembran in einem detergenshaltigen Puffer befinden sich neben dem gesuchten Protein auch viele andere Membranproteine in Lösung. Im letzten Schritt wird das stark angereicherte Membranprotein durch Ionenaustausch-Chromatographie von anderen isoliert.

Es tritt als breite, dunkle Bande hervor und trennt sich, hier in der Zeitraffung dargestellt, während des Laufs durch die Säule von den übrigen Proteinen ab. Letztere werden verworfen, das Zielprotein von der Säule gelöst und zu einem Fraktionssammler geleitet.

Jetzt sind die Voraussetzungen für eine Kristallisation gegeben. Das Proteinkonzentrat wird in eigens dafür vorgesehene Kristallisationsschalen pipettiert.

Anschließend wird der Proteinsuspension bei konstanter Temperatur das Wasser allmählich entzogen. Hierdurch kommen die Proteinmoleküle in engen Kontakt zueinander und aggregieren zu Proteinkristallen.

Zeitraffung verdeutlicht diesen mehrere Tage dauernden Prozess. Die Kristalle bestehen aus vielen Millionen identischer Membranproteine. Wenn die Proteine in der Suspension aufgebraucht sind, hört das Kristallwachstum auf.

Die nun 1-3 mm grossen Kristalle werden für eine Untersuchung der Kristallstruktur vorbereitet. Ein ausgewählter Kristall wird in eine Messkapillare gezogen.

Die Enden der Kapillare versiegelt man mit Wachs, um den äußerst labilen Proteinkristall vor dem Zerfall durch Austrocknung zu schützen. Der dreidimensionale Bau des Proteins wird nun durch eine Röntgenstrukturanalyse aufgeklärt.

Hierzu justiert man die Glaskapillare mit dem Kristall im Strahlengang der Röntgenquelle. Der Detektor fährt dicht heran.

Anschließend trifft der Röntgenstrahl auf den Kristall. Dabei beugt der Proteinkristall den Röntgenstrahl. Ein Detektorschirm nimmt das Beugungsmuster auf. Der Kristall wird nun schrittweise um seine Achse gedreht.

Die ansonsten unsichtbaren Röntgenstrahlen sind hier veranschaulicht worden. Für jeden Winkel werden die Beugungsmuster im Computer miteinander verrechnet. Wie der Orthopäde aus einem Röntgenbild die genaue Lage der Knochen oder Wirbel zueinander erkennt, gibt das Beugungsmuster dem Kristallografen Auskunft über die Lage jeder einzelnen Aminosäure im Membranproteinkristall.

Dem Kristallografen genügen allerdings nicht Unterschiede im Millimeterbereich. Er muss eine Auflösung von ein bis zwei Angstströmen, d.h. von einem Zehn-Millionstel-Millimeter erreichen, um den dreidimensionalen Bau eines Kaliumkanals aufzuklären.

Hier nun das Ergebnis einer solchen Analyse am Kaliumkanal von Streptomyces lividans, einem Bakterium. Wie in der Aufsicht zu sehen, setzt sich der Kanal aus vier identischen Untereinheiten zusammen. Im Zentrum des Kanalkomplexes liegt die jonenleitende Pore mit den Kaliumionen.

Nach Drehung um 90 Grad lässt sich erkennen, dass diese vier Untereinheiten aus alpha-helikalen Bereichen bestehen, welche sich aus 17 bis 21 Aminosäuren zusammensetzen und das Membranprotein in der Membran verankern.

Nach Ausblenden der vorderen und hinteren Untereinheit ist der kaliumselektive Bereich der Pore sichtbar. An der engsten Stelle des Kanals liegen die drei aufeinanderfolgenden Aminosäurenglyzin, Tyrosinglyzin, welche allen Kaliumkanälen gemeinsam sind.

Diese so wichtige Durchlassstelle für Kaliumionen wird von zwei Poren Helizes stabilisiert. Der Weg eines Kaliumions durch die Kanalpore lässt sich an einem einfachen Modell verfolgen.

Das negative Membranpotenzial zieht ein Kaliumion an, es tritt in die Pore ein, bindet am Filter, bis ein zweites andockt und aufgrund der gleichen Ladung das erste elektrostatisch abstößt. Negative Ladungen am Poreneingang verhindern den Eintritt von Anionen, hier silbrig dargestellt.

Eine Selektivität für Kalium gegenüber anderen Kationen ist durch die spezifischen Bindungsstellen am Filter gegeben. Durch die gegenseitige Abstoßung der Kaliumionen werden Durchtrittsraten von 10 hoch 7 Ionen pro Sekunde erreicht.

Kommt es zu Mutationen, werden die Ionenkanäle in ihrer Funktion beeinträchtigt. Zuweilen verlieren sie sogar die Kanalfunktion ganz. Diese genetischen Defekte führen bei Pflanzen zu Fehlfunktionen von Schließzellen, Wachstumsstörungen von Spross und Wurzel und stehen bei Menschen

in Zusammenhang mit Erbkrankheiten wie Herzrhythmusstörungen, Epilepsie oder Mukoviszidose.

eine wichtige Voraussetzung, zum Beispiel für die Entwicklung neuer Therapiekonzepte und die gezielte Optimierung in der Pflanzenzüchtung. Die Informationen zur Umsetzung stecken in den Proteinkristallen. Diese Strukturanalysen erlauben, zusammen mit biophysikalischen

und molekulargenetischen Analysen, den Schritt vom Molekül zur Anwendung.