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Chromatographische Trennungen werden mit verschiedenen Techniken durchgeführt. Hier zunächst eine Apparatur zur Gas-Chromatographie für adsorptions- oder verteilungs- chromatographische Trennungen in der Gasphase. Für flüssigkeitschromatographische Trennungen
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in Säulen werden unterschiedliche Trennmechanismen benutzt. Besteht die stationäre Phase aus größeren Trennpartikeln, so kann die flüssige, mobile Phase mit Hilfe einer peristaltischen Schlauchpumpe gefördert
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werden. Eine Präzisionshochdruckpumpe wird dagegen
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benötigt, um die mobile Phase mit optimaler Durchflußgeschwindigkeit durch eine
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dünne Säule zu pumpen, die sehr kleine Trennpartikel enthält. Die moderne Technik der Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie in Säulen ermöglicht sehr rasche Trennungen. In der Dünnschicht-Chromatographie werden vergleichbare
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Trennergebnisse ohne aufwendige apparative Hilfsmittel
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erzielt. Dafür werden jedoch längere Trennzeiten benötigt. Hier dienen Aluminiumfolien, Kunststoff-Folien oder Glasplatten in verschiedenen Formaten als Träger für die stationäre Phase. Auf den Platten befinden sich die unterschiedlichen Adsorbentien, Gele oder Ionenaustauscher als dünne
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Schichten von etwa 0,1 mm Dicke. Bei qualitativen Analysen kann die Probelösung, welche die zu
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trennenden Stoffe im Gemisch enthält, am einfachsten mit Mikrokapillaren aus
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Glas aufgebracht werden. In der Dünnschicht-Chromatographie erzielt man präzisere, quantitative
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Ergebnisse, indem man sämtliche Schritte
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vor Beginn einer Trennung automatisiert. Für quantitative Analysen bis in
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den Spurenbereich stehen Analysen-Geräte zur
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Verfügung, die exaktes Dosieren bis herab zu Nanoliter-Volumina ermöglichen. Vor
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der Probenahme wird die Dosierkapillare zunächst gespült. Dann erfolgt die Entnahme eines festgelegten Volumens aus
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den Probefläschchen. Die Probevolumina werden
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präzise und in vorher programmierten Abständen auf die Startlinie der Dünnschichtplatte aufgetragen. Auch das strichförmige
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Auftragen läßt sich unter Verwendung von Mikroliterspritzen mit Hilfe dieses Gerätes optimal durchführen. Zur dünnschicht-chromatographischen Trennung werden die mobilen Phasen in Trennkammern unterschiedlicher Form eingefüllt
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- hier in eine Flachbodenkammer mit einer relativ großen Gasphase. Für den Erfolg und die Reproduzierbarkeit einer Trennung sind auch die Gleichgewichtseinstellungen zwischen Fließmittel und Gasphase sowie zwischen Gasphase, dem Fließmitteldampf und der trockenen Trennschicht von Bedeutung. Hier wird die Dünnschichtplatte zwischen zwei Glasplatten gelegt. Es handelt sich um eine sog. Sandwich-Kammer. Darin wird eine Wechselwirkung zwischen trockener Schicht und der Gasphase unterbunden; man erhält gut reproduzierbare Trennungen. Das nächste Beispiel zeigt eine sog. Linear-Entwicklungskammer. Von dem Fließmittel wird nur das benötigte Volumen eingesetzt. Die
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chromatographische Trennung kann von zwei
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Seiten erfolgen. Dieses System ermöglicht
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eine weitgehende Kontrolle der Chromatographie- Bedingungen. In der Zirkular-Chromatographie wird diese sog. U-Kammer eingesetzt. Das
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Fließmittel gelangt über die Spritze direkt auf die Schicht. An der Peripherie lassen sich zahlreiche Proben auftragen. Bei der Antizirkular-Entwicklung
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wird das Fließmittel an der Kreisperipherie zugeführt. Dadurch werden Querdiffusionen unterdrückt, die zu verbreiterten Substanzflecken führen würden. Die Flußrate ist anders als bei den bisherigen
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Trennkammern regelbar und während einer Trennung konstant. B ei der zuvor gezeigten linearen Entwicklung verringert sich dagegen die Flußrate mit der fortschreitenden Wanderung der Fließmittelfront. Bei der Zirkular-Entwicklung wird das Fließmittel in der Mitte zugeführt. Vor allem in der Nähe des Startpunktes werden hier schärfere Trennungen als mit der linear en Entwicklung erreicht. Der Übergang vom punkt- zum strichförmigen Auftragen bringt selbst in der linearen Entwicklung eine zusätzliche Verbesserung der Trennungen. Auch nicht gefärbte Substanzen lassen sich durch Besprühen mit Reagentien chromatographisch analysieren. Die Umwandlung in farbige Stoffe erfolgt dabei direkt auf der Schicht. Das
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gleiche Ergebnis ist schneller und besser durch Eintauchen in die
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Reagenzlösung zu erreichen. Mengen bzw. Konzentrationen werden anschließend beispielsweise photometrisch
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bestimmt. Mit Hilfe dieses speziellen DC-Scanners können photo- oder auch fluorimetrische Messungen direkt auf der Schicht vorgenommen werden. Die Größe
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der Substanzflecken und deren Lage auf der Schicht werden in ein geplottetes Chromatogramm umgesetzt - wie wir es aus der Säulen-Chromatographie gewohnt sind. Damit wird
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auch die gleiche numerische Auswertung möglich wie bei der Gas-oder Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie. Die Hochleistongs-Flüssigkeits-Chromatographie in Säulen, kurz HPLC genannt, erzielt vergleichbare
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Trennleistungen wie die instrumentelle Dünnnschicht-Chromatographie. Ein HPLC-Gerät besteht aus einem
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Probeaufgabeteil, einer Hochdruckpumpe, einer dünnen Säule mit Teilchen von wenigen Mikrometern Durchmesser und einem Durchflußdetektor mit Schreiber oder Integrator. Eine
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Lösung des zu trennenden Substanzgemisches wird mittels einer Spritze in die Probenschleife des Probeaufgabesystems überführt. Durch Umschalten des Ventils wird die mobile Phase über die Probenschleife in die HPLC-Säule geleitet. Dieses Säulensystem benutzt eine speziell
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gesicherte Einspannvorrichtung für Glaskartuschen, die auch bei hohen Drucken stabil sind. Hier der normale zeitliche Ablauf eines Trennprozesses. Bei der Gradientenelution wird die Mischung zweier unterschiedlicher Lösungsmittel in der mobilen Phase kontinuierlich verändert. Dadurch wird die benötigte Elutionszeit erheblich verkürzt. Die hier getrennten Stoffe werden nach der Elution aus der Säule im Durchflußphotometer detektiert. Chemische Reaktionen, wie sie beim Besprühen von Dünnschichtplatten eintreten, lassen sich in Verbindung mit der HPLC auch in chemischen Reaktionsdetektoren durchführen.
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Nach der üblichen HPLC-Trennung werden dem Eluentenstrom über Schläuche direkt hinter der Säule Reagenzlösungen zugeführt. Eine Luftsegmentierung verhindert die Vermischung vorher getrennter Stoffe. Die Durchmischung erfolgt in Glasspiralen. Ein Farbumschlag
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zeigt die vorher farblosen Stoffe
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an. Die Lösung wird durch eine Durchflußküvette gepumpt. Bei einer fest eingestellten Wellenlänge wird die Konzentration des Farbstoffes mit Hilfe der Lichtabsorption photometrisch erfaßt. Zum
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Nachweis UV-absorbierender Stoffe dient ein
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UV-Detektor. Bei fluoreszierenden Stoffen wird
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ein Fluoreszenzdetektor und bei Ionen
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ein Leitfähigkeitsdetektor eingesetzt. In der
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Gas-Chromatographie ist die Trennsäule in
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einen Ofen eingebaut. Die Trennsäule
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enthält eine bei der Ofentemperatur flüssige Phase auf einem Trägermaterial.
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Hier ein Blick in den Detektorraum am Ende der Trennsäule bzw. des Ofens. Im Flammenionisations- Detektor werden getrennte flüchtige organische Stoffe in einer Wasserstoff- Luft-Flamme verbrannt. Die gebildeten Ionen werden als Stromstärke registriert. Werden anstelle
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einer gepackten Trennsäule Trennkapillaren benutzt, die kein Trägermaterial enthalten, so lassen sich höhere Trennleistungen erzielen.
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Die flüssige Probe wird mit einer Mikroliterspritze durch ein Septum
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in den Probeneinlaß gespritzt. Dort verdampft die Probe bei höherer
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Temperatur als in der Trennsäule. Mit Hilfe des Trägergasstromes werden die getrennten Stoffe durch die Säule transportiert und gelangen so nacheinander in den Detektor. Die
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Auswertung der Chromatogramme kann zusätzlich mit Hilfe eines elektronischen Integrators erfolgen.
