Interzelluläre Kommunikation über Gap junctions
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Formal Metadata
| Title |
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| Alternative Title |
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| Author | ||
| Contributors | ||
| License | CC Attribution - NonCommercial - NoDerivatives 3.0 Germany: You are free to use, copy, distribute and transmit the work or content in unchanged form for any legal and non-commercial purpose as long as the work is attributed to the author in the manner specified by the author or licensor. | |
| Identifiers | 10.3203/IWF/C-1624 (DOI) | |
| IWF Signature | C 1624 | |
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| Production Year | 1986 |
Technical Metadata
| IWF Technical Data | Film, 16 mm, LT, 113 m ; F, 10 1/2 min |
Content Metadata
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| IWF Classification |
Transcript: German(auto-generated)
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Zellen sind Bausteine von Geweben oder Organen. Wie werden zwischen ihnen Informationen weitergeleitet, die für die Koordinierung lebenswichtiger Funktionen sorgen? Hier eine Kultur synchron schlagender Herzzellen.
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Ihre rhythmischen Kontraktionen werden durch einen Ionenstrom gesteuert, der sowohl über die Membranen als auch über Kanälechen direkt von Zelle zu Zelle fließt. Diese submikroskopisch kleinen Kanälechen ordnen sich meist zu charakteristischen Aggregationen in den Plasmamembranen an und werden Gap Junctions genannt.
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Plasmamembranen tierischer Zellen bestehen aus Lipid-Doppelschichten, durchsetzt mit frei beweglichen Proteinen. Kanalbausteine gehören zu diesen Proteinen. Sie lagern sich unter geeigneten Bedingungen aneinander an und bilden so einen zunächst geschlossenen Gap Junction Halbkanal, das Konnexon.
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Dessen extrazelluläre Seite kann mit einem Konnexon einer benachbarten Zelle eine stabile Verbindung eingehen, was beide Zellen punktuell bis auf 3 Nanometer aneinander bringt. Nach und nach lagern sich weitere Konnexone an und heften die beiden Zellen wie mit Druckknöpfen aneinander.
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Eine funktionsfähige Gap Junction, hier von schräg oben gesehen, setzt sich aus bis zu mehreren tausend Konnexonen zusammen. Erst jetzt öffnen sich die Konnexone und bilden Kanälchen, um Signale von einer Zelle zur anderen durchzulassen.
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Sie öffnen sich jedoch nicht alle gleichzeitig, sondern wechseln zwischen geschlossenen und verschiedenweit geöffneten Zuständen. Dadurch kann nicht nur der Signalfluss variiert werden, sondern es ist auch aufgrund der unterschiedlichen Größe der durchtretenden Moleküle eine Übermittlung verschiedenster Nachrichten möglich.
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Die maximale Öffnung eines Konnexons hat einen Durchmesser von ca. 1,5 Nanometer, was den Austausch von Partikeln mit einem Molekulargewicht bis zu 900 Dalton zulässt. Elektronenmikroskopisch ist die Öffnung der Konnexone nicht zu erkennen.
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Die Konnexonanordnung lässt sich jedoch durch Brechen tiefgefrorener Zellen im Hochvakuum darstellen. Da die Lipiddoppelschicht wie eine Sollbruchstelle wirkt, verlaufen die Bruchflächen fast immer innerhalb der Zellmembranen, sodass die inneren Membranschichten freigelegt werden.
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Dabei bleiben die Konnexone in der plasmatischen Schicht stecken, während die äußere Schicht durch die Löcher der herausgezogenen Proteine charakterisiert ist. Durch Schrägbedampfung mit Platin werden diese Strukturen als Erhebungen und Vertiefungen plastisch hervorgehoben. Zur Stabilisierung der Platinschicht wird von oben ein Kohlefilm aufgedampft.
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Im Anhydrit der Chromsäure werden die Zellreste abgelöst. Nur der Platinkohleabdruck bleibt bestehen und kann im Elektronenmikroskop abgebildet werden.
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Diese Gap Junction zeigt links den Abdruck einer plasmatischen Membranschicht mit stecken gebliebenen Konnexonen und rechts den Abdruck der äußeren Membranschicht mit den Löchern herausgezogener Konnexone einer angekoppelten Zelle.
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Solche interzellulären Verbindungen lassen sich nicht nur elektronenmikroskopisch, sondern auch elektrophysiologisch nachweisen. Dazu benötigt man Glasmikropipetten. Diese stellt man aus 1 mm dicken Glaskapillaren her, die in einer Glühwendel langsam erhitzt und ruckartig auseinandergezogen werden.
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Mit ihrer Hilfe lassen sich in Kulturen, wie hier in Brusttumorzellen der Marshallratte, geöffnete Gap Junctions nachweisen. Im Phasenkontrast wird eine mit fluoreszierendem Farbstoff gefüllte Mikropipette in eine Zelle des Zellrasens eingestochen.
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Nach Umschalten auf UV-Licht ist nur noch die Mikropipette zu erkennen, aus der die Injektion des Farbstoffs in die angestochene Zelle durch Anlegen einer negativen Gleichspannung erfolgt.
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Auch nach Abschalten der Injektionsspannung und Herausziehen der Mikropipette breitet sich die Fluoreszenz weiter in die benachbarten Zellen aus. Der hier verwendete Farbstoff Lucifer Yellow hat ein Molekulargewicht von 457 Dalton
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und kann daher rasch über die Gap Junction-Kanälchen in benachbarte Zellen diffundieren. Die Zellkerne fluoreszieren stets heller als das Zytoplasma. Die Überblendung zurück in den Phasenkontrast verdeutlicht dies und bringt die Anordnung der Zellen noch einmal in Erinnerung.
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Das gleiche Experiment wird jetzt mit einer Kultur epitheloid wachsender Hela-Zellen durchgeführt. Diese Zellen entstammen einem menschlichen Gebärmutterhalskrebs.
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Wiederum wird für etwa 10 Sekunden in eine Zelle Lucifer Yellow injiziert und die Mikropipette wieder zurückgezogen.
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Im Gegensatz zu den Brusttumorzellen breitet sich hier der Farbstoff auch nach längerer Beobachtungszeit nicht in andere Zellen aus. Das Fehlen der direkten interzellulären Kommunikation belegen auch elektronenmikroskopische Untersuchungen, die keinen Hinweis auf Gap Junctions zwischen Hela-Zellen ergaben.
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Die Überblendung in den Phasenkontrast zeigt nochmals den engen Kontakt dieser Hela-Zellen, der aber nicht notwendigerweise den Aufbau interzellulärer Kanälchen zur Folge hat. Der Kopplungsgrad lässt sich quantitativ erfassen, indem den Zellen ein künstliches elektrisches Signal aufgezogen wird.
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Dazu benutzt man elektrolytgefüllte Mikropipetten, sogenannte Mikroelektroden, die unter mikroskopischer Kontrolle eingestochen werden. Mechanisch oder elektrisch gesteuerte Mikromanipulatoren ermöglichen eine exakte Führung der Elektroden.
07:24
Die stromführende ist hier bereits in einer Brusttumorzelle platziert. Zwei weitere werden in dieselbe und in eine benachbarte Zelle zur Membranpotentialmessung eingestochen.
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Das Messergebnis kann auf vielfältige Weise registriert werden. Beispielsweise mit einem Schreiber, wo die den Membranpotentialen überlagerten Antworten ebenso aufgezeichnet werden wie die injizierten Stromsignale.
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Signalpulse von Millisekundenlänge registriert man mit dem Oszilloskop. Die beiden oberen Spuren werden nach dem Anstechen der beteiligten Zellen proportional zum Membranpotential ausgelenkt. Die untere Spur zeigt jetzt die injizierten rechteckigen Stromsignale.
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Und die Antwort der beiden Zellen kann mit ihren Membranpotentialen abgelesen werden. Experimente mit Enzymdefekten und normalen Zellen haben ergeben, dass für das Zellwachstum notwendige Metabolite und Nukleotide über die Gapjunctions ausgetauscht werden können.
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Ferner gibt es Hinweise, dass sowohl bei der embryonalen Entwicklung als auch bei der maligenen Entartung von Zellen diese interzelluläre Kommunikation beteiligt ist. Welche Signale von Zelle zu Zelle auf diesem Wege weitergegeben werden, wissen
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wir nur für ganz wenige Systeme, beispielsweise für die zu Beginn gezeigten Herzzellen. Wie hier mit Lucifer Yellow wird daher die Funktion der Gapjunctions und der durch sie gesteuerte interzelluläre Signalfluss bisher noch überwiegend mit künstlich aufgezwungenen Signalen untersucht.
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