Lasermikrostrahl und optische Pinzette - Physikalische Grundlagen. Anwendung in Zellbiologie und Biotechnologie
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Formal Metadata
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| Contributors | ||
| License | CC Attribution - NonCommercial - NoDerivatives 3.0 Germany: You are free to use, copy, distribute and transmit the work or content in unchanged form for any legal and non-commercial purpose as long as the work is attributed to the author in the manner specified by the author or licensor. | |
| Identifiers | 10.3203/IWF/C-1897 (DOI) | |
| IWF Signature | C 1897 | |
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| Producer | ||
| Production Year | 1994 |
Technical Metadata
| IWF Technical Data | Video ; F, 26 1/2 min |
Content Metadata
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| IWF Classification |
Transcript: German(auto-generated)
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Die tropische Meereseilge Pyrocystis noctiluca ist annähernd kugelförmig und von einer festen Zellwand umgeben.
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Ihr Durchmesser kann bis zu 300 Mikrometer betragen. Sie gehört zu den Organismen, die Meeresleuchten erzeugen. Beim Durchfokussieren werden die Innenstrukturen des Einzellers deutlich.
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Zahlreiche Plasmastränge gehen von dem dunklen Zellkernbereich aus. Die feste Zellwand verhindert eine mechanische Mikromanipulation und ist auch für viele in der Zellbiologie verwendeten Substanzen undurchlässig. Hier bietet sich die Anwendung der Lasermikrostrahltechnik an,
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mit der berührungsfrei und ohne Verletzung der äußeren Hülle in der Tiefe des Objekts gearbeitet werden kann. Laserlicht dient dabei als Werkzeug zum Schneiden oder Bohren von Löchern. Schon geringe Laserenergien genügen, um einzelne Plasmastränge exakt zu durchtrennen.
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Der Plasmastrang steht unter einer starken Spannung und zieht sich daher schnell zusammen. Welche Bedeutung haben die plasmatischen Strukturen für Aufbau und Funktion einer Zelle? Und wie wird die innere Zellstruktur stabilisiert?
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Durch eine gezielte Zerstörung mit dem Lasermikrostrahl lassen sich solche Fragestellungen am lebenden Objekt untersuchen. Welche Eigenschaften hat nun Laserlicht im Vergleich zu einer herkömmlichen Lichtquelle wie einer Glühlampe? Eine Glühlampe sendet Photonen in alle Richtungen des Raums aus.
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Das heißt, das Licht ist divergent. Die einzelnen Wellenzüge sind insgesamt kurz, aber unterschiedlich in der Länge und ungeordnet, also inkohärent. Auch die Wellenlängen unterscheiden sich geringfügig. Das Licht ist nicht monochromatisch.
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Vom Licht einer Glühlampe unterscheidet sich Laserlicht in drei wesentlichen Merkmalen. Die Wellenzüge verlassen den Laser annähernd parallel. Auch über große Entfernungen nimmt ein Laserlichtbündel nur wenig an Durchmesser zu.
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Die Wellenzüge sind sehr lang. Wellenthäler und Wellenberge treten geordnet auf. Das Laserlicht ist also kohärent. Schließlich sind die Wellenlängen alle identisch. Das heißt, das Licht ist monochromatisch.
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Auch bei der Fokussierung des Lichts durch eine Linse werden die Unterschiede deutlich. Bei dem Licht der Glühlampe bleibt die Fokussierung wegen der großen Divergenz unvollständig. Laserlicht lässt sich viel besser fokussieren als Glühlampenlicht.
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Der minimal erreichbare Fokussdurchmesser wird nur durch die Wellenlänge des verwendeten Lichts begrenzt. Der Durchmesser der Strahlteile des fokussierten Strahls ist deutlich unterschiedlich. Durch seine Eigenschaften eignet sich Laserlicht gut als Werkzeug für Mikromanipulationstechniken in Kombination mit einem Mikroskop.
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Dabei wird der Laserstrahl über Linsensysteme in den Mikroskopstrahlengang eingekoppelt. Ein kontinuierlicher Neodymiac-Laser im Infrarotbereich dient zum Festhalten und Bewegen von Partikeln,
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während mit einem Stickstofflaser, der Ultraviolettlichtpulse erzeugt, geschnitten, gebohrt und geschweißt werden kann. Dies ist eine solche Lasermikrostrahlapparatur, bestehend aus einem inversen Mikroskop und den eingekoppelten UV- und Infrarotlasern.
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Der Mikroskop-Tisch wird über einen Joystick mit Koordinatenanzeige kontrolliert.
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Da die Laser auf die Objektebene fokussiert sind und somit dort einen festen Brennpunkt haben, müssen die Objekte in den Fokus des Laserstrahls bewegt werden. Mit dem Infrarotlaser als optischer Pinzette können Organellen oder auch ganze Zellen festgehalten und verlagert werden.
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Da die verwendeten Laser Licht im nicht sichtbaren Bereich imitieren, wird von jetzt ab jeweils die Lage des Laserfokus angezeigt. Hier wird ein Partikel aus dem Zytoplasma in Richtung Vakuole bewegt.
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Er bleibt mit seiner ursprünglichen Position durch einen feinen Strang verbunden und kehrt bei Ausschalten des Lasers in seine Lage zurück.
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Vom Zytoplasma ist die Vakuole durch eine Membran, den Tonoplasten, abgegrenzt. Auch der Zytoplasmer Strang besteht weitgehend aus dieser Membran. Daher können mit der optischen Pinzette in der lebenden Zelle die viskoelastischen Eigenschaften von Membranen untersucht werden.
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Die Strahlungsintensität in einem Laser ist nicht gleichförmig. Vielmehr ähnelt das Intensitätsprofil einer Gaussverteilung. Was geschieht nun, wenn Licht auf eine Zelle trifft? Da sich deren Brechungsindex von dem des umgebenden Mediums unterscheidet, wird ein Photon in seine Richtung abgelenkt.
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Die Zelle hat entsprechend einen Rückstoß in die andere Richtung erfahren. In diesem Fall in Richtung der optischen Achse.
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Hier noch einmal in der Wiederholung. Trifft ein Photon die Zelle unterhalb des Mittelpunkt, so wird es selbst in Richtung Strahlmitte abgelenkt. Bei homogener Verteilung der Strahlungsintensität im Laserstrahl würden sich die Effekte aufheben.
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Da aber die Intensität in der Strahlmitte höher ist und mit der Entfernung von der optischen Achse abnimmt, wird die Zelle insgesamt zur optischen Achse hin bewegt und dort im Fokus fixiert.
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Die Grünalge Chara verankert sich im Boden von Gewässern mit wurzelähnlichen einzelligen Haftorganen, den Rhizoiden. Die Rhizoiden bilden sich an den Internodien der Algen aus und können bis zu mehreren Millimetern lang werden.
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Im Inneren ist eine intensive Plasmaströmung zu erkennen. Die Zellen wachsen positiv gravitrob, das heißt der Schwerkraft folgend nach unten. An der Schwerkraftwahrnehmung sind die Statuliten, kleine membranumhüllte Kristalle aus Barium-Sulfat beteiligt.
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Durch ihre Verlagerung wird auch die Wachstumsrichtung der Rhizoiden beeinflusst. Die Statuliten haben einen höheren Brechungsindex als das sie umgebende Zytoplasma. Sie werden daher von der optischen Pinzette eingefangen und im Fokus des Laserstrahls gehalten.
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Der Statulitenkomplex wird durch Aktivfilamente in seiner Position einige Mikrometer oberhalb der Rhizoidspitze fixiert. Die Kräfte, die diese Aktivfilamente ausüben, lassen sich mit der optischen Pinzette bestimmen.
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Die Kraft der optischen Pinzette ist proportional zur Laserleistung und hängt von der Partikelgröße und dem relativen Brechungsindex ab.
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Einige Milliwatt an Leistung ergeben hierbei einige pico Newton an optischer Kraft.
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Partikel aus einer schnellen Strömung herauszufangen ist mit der optischen Pinzette ebenfalls möglich. In Chara Rhizoiden beträgt die Plasmaströmung bis zu 50 Mikrometer pro Sekunde. An der Bewegung sind Aktivfilamente und Myosine als Motormoleküle beteiligt.
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Auch nach der Verlagerung in die zentrale Vakuole bleiben die Plastiden mit dem Zytoplasma durch einen dünnen Strang verbunden.
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Die zytoplasmatische Verbindung übt einen elastischen Zug aus und zieht die Partikel schließlich wieder zurück in die Plasmaströmung. Jetzt sind die feinen Zytoplasmastränge besonders gut zu erkennen.
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Mit dem Einfangen von Plastiden durch die optische Pinzette sind Kräftemessungen im Zytoplasmatransport möglich. Man erhält so unmittelbare Einblicke in die Dynamik einer lebenden Zelle. Die Riesenamöbe Reticulomyxaphylosa besitzt einen zentralen Zellkörper aus dicken Protoplasmasträngen
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und ein peripheres, reich verzweigtes Netzwerk aus feinen Protoplasma-Fäden. Letzteres kann eine Fläche von mehreren Quadratzentimetern bedecken. Entlang der Adern des flach ausgebreiteten Netzwerks ist ein lebhafter Organellentransport zu erkennen.
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Die organellen Bewegung gehört mit 10 bis 15 Mikrometer pro Sekunde zu den schnellsten, die jemals bei tierischen Zellen beobachtet wurden. Die stark lichtbrechenden Partikel sind Mitochondrien mit einem Durchmesser von 0,2 bis 0,4 Mikrometer.
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Im Phasenkontrast erscheinen die Mitochondrien nahezu schwarz. Gegenläufige Bewegungen dieser Organellen können selbst in unmittelbarer Nachbarschaft ohne gegenseitige Beeinflussung auftreten. Auch sind häufige Richtungswechsel zu beobachten.
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Der Transport erfolgt entlang von Mikrotubuli, die das Zytoplasma in großer Zahl durchziehen. Richtet man die optische Pinzette auf einen Plasmafaden, so werden auch einige Mitochondrien gestoppt. Diese dienen dann als Angriffspunkt für das seitliche Herausziehen eines Membranstranges.
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Nach Ausschalten des Lasers schnappt der Membrantubus zurück und wird resorbiert. Die Ansatzstelle des Membranschlauches ist sehr beweglich, was auf eine hohe Membranfluidität hinweist.
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Beim Berühren eines benachbarten Zytoplasmafadens kommt es sofort zu einer Fusion. Die so entstandene Verbindung wird dann häufig passiv wegtransportiert.
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Neben Phänomenen wie Membrandynamik und Membranflexibilität können mit der optischen Pinzette auch Bewegungsvorgänge in Zellen quantitativ untersucht werden. Entlang der Mikrotubuli transportierte Organellen können gestoppt und nach Ausschalten des Lasers wieder freigelassen werden.
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Die Ausgangsleistung des Lasers ist dabei proportional zu der auf das Organell wirkenden Kraft. Pollenkörner wie die von Lilium Longiflorum haben komplex aufgebaute Zellwände.
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Die innere Schicht enthält Zellulose. Die äußere, oft ornamentierte Lage besteht aus Sporopollenin und wird als Exine bezeichnet. Mit dem UV-Laser lässt sich die Exine ohne Verletzung der inneren Schicht abtragen.
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Dies ist möglich, da die höchste Photonendichte auf einen Bereich von etwa ein Kubik Mikrometer konzentriert ist. Die exakte Oberflächenbearbeitung macht die Präzision des Lasermikrostrahls deutlich.
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An Pollen-Schläuchen von Lilium Longiflorum wird nun die Wirkung des UV-Lasermikrostrahls demonstriert. Sie dienen häufig als Modell zur Untersuchung von Plasmaströmungen. Ein kurzer Laserpuls führt zu einer Kontraktion im Zytoplasma.
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Die organellen Bewegung kommt zum Stillstand. Der Vorgang ist reversibel. Nach einiger Zeit setzt die Plasmaströmung erneut ein. Im Pollen-Schlauch werden die organellen entlang von Aktinfilamenten transportiert.
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Calcium-Ionen sind an der Strömungsregulation wesentlich beteiligt. Durch den Laserpuls werden kurzfristig Calcium-Ionen aus intracellulären Speichern wie endoplasmatischem Retikulum und Mitochondrien freigesetzt.
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Bei erhöhten Calcium-Ionen-Konzentrationen zerfallen die Aktinfilamente und die Plasmaströmung kommt zum Stillstand. Die Fragmentierung der Filamente lässt sich durch Anfärbung mit Rodamin Phalloidin nachweisen.
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Diese Protoplasten wurden aus Blattgeweben des Rapses durch enzymatischen Abbau der Zellwände isoliert. Sie enthalten ihre genetische Information außer im Zellkern noch in Mitochondrien und Chloroplasten.
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Mit der Lasermikrostrahlmethode ist es möglich, fremde DNA in Chloroplasten einzuschleusen. Dazu wurde vorab Nukleinsäure in das Zellcytoplasma microindiziert. Ein Chloroplast wird nun durch einen Schuss mit dem UV-Laser geöffnet und flüssigkeitsströmt ein.
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Nach kurzer Zeit schließt sich die Membranöffnung wieder. Mit dem Laser lassen sich Zellen unter Sichtkontrolle miteinander fusionieren.
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Diese Protoplasten aus dem Mesophil des Rapses befinden sich bereits in engem Kontakt. Ihre Membranen sollen im Berührungsbereich durch mehrere Laserpulse geöffnet werden. Da der UV-Laser nicht sichtbar ist, muss mehrfach durchfokussiert werden, um Treffer zu erzielen.
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Hier wurde zunächst die Plasmamembran der linken Zelle durchtrennt. In diesem Bereich zieht sich das Zytoplasma zurück. Mit Eröffnung der rechten Zelle beginnt die Verschmelzung.
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Allmählich rundet sich das Fusionsprodukt ab. Es vergehen aber noch einige Minuten, bis die Abrundung vollendet ist. Die Zytoplasmadurchmischung jedoch dauert noch mehrere Stunden.
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Diese Hypokotylprotoplasten wurden aus dem unteren Sprossabschnitt von Rapspflanzen isoliert. Sie haben keine Chloroplasten ausgebildet. In den 50 bis 60 Mikrometer großen Zellen lassen sich die zytoplasmatischen Strukturen gut erkennen.
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Durch Laserpulse wird erst die Membran der linken, dann die der rechten Zelle geöffnet und so die Fusion eingeleitet. Kurze Zeit später zerreißen die Plasmastränge, die den Zellen ihre Form geben.
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Durch die Laserpulse wird die zytoplasmatische Organisation völlig zerstört. Erst nach einer halben Stunde lassen sich neu aufgebaute Strukturen nachweisen.
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Bei der Fusion werden die genetischen Informationen unterschiedlicher Zellen miteinander kombiniert. Es entstehen so Hybride mit neuen Eigenschaften.
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Bei einer günstigen Ausgangslage der Zellen kann die Verschmelzung sehr rasch stattfinden. Bei diesen Hypokotylprotoplasten beträgt die Gesamtzeit vom ersten Laserpuls bis zur Abrundung zum Fusionsprodukt circa 30 Sekunden.
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Aus der Hybridzelle kann später eine vollständige Pflanze regenerieren. Hier nun eine Fusion von drei Zellen. Begonnen wird mit den beiden Hypokotylprotoplasten in Bildmitte.
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Während des Verschmelzungsprozesses sind die Kerne der Ausgangszellen besonders gut zu erkennen. Das Fusionsmedium ist ein übliches Pflanzenzellkulturmedium, dem Glucose oder Sorbit zugegeben wurde.
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Durch die Zugabe des Monosacharids ist gewährleistet, dass der osmotische Wert des Mediums dem osmotischen Innendruck der Zellen entspricht.
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Erst nach fast vollständiger Abrundung des Fusionsproduktes wird die Plasmamembran der einzelnen Zelle links durch mehrere Laserpulse geöffnet. Es entsteht ein Dreifachhybrid.
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Während der Verschmelzung werden auch die Membrankomponenten der verschiedenen Ausgangszellen miteinander vermischt. Die Eigenschaften dieser neu zusammengesetzten Membran zu untersuchen, ist eine weitere Anwendungsmöglichkeit der Zellfusion.
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Auch Säugerzellen wie diese Myelomzellen können fusioniert werden. Allerdings ist die Ausbeute an überlebenden Hybriden geringer als bei der Protoplastenfusion. Die Zellen reagieren zudem sehr empfindlich auf osmotische Veränderungen des Mediums.
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Der Fusionsprozess läuft erheblich langsamer ab. Bei Säugerzellen nehmen die Kerne einen großen Teil des Zellvolumens ein. Daher dauert es mehrere Stunden, bis eine Hybridzelle entstanden ist. Rote Blutkörperchen schrumpfen in hypertonischer Lösung und bilden Stechapfelformen.
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So bezeichnet wegen der faserigen Ausbuchtungen der Zellmembran. Wird diese Membran mit dem UV-Laser perforiert, so quillt der Erythrozyt auf und erhält wieder seine ursprüngliche Form.
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Dies ist ein weiteres Beispiel für die Injektion von Material in Zellen. Durch das osmotische Gefälle zwischen Medium und Zellinneren wird zwar Material aus der Umgebung aufgenommen,
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da aber die Zellmembran die Fähigkeit besitzt, das Loch in kürzester Zeit wieder zu schließen, kommt es nicht zum Platzen der Zelle. Die 46 Chromosomen des menschlichen Chromosomensatzes bestehen aus 22 Autosomenpaaren und zwei Geschlechtschromosomen.
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Es gibt zahlreiche Erkrankungen, die durch mikroskopisch erkennbare Defekte an Chromosomen verursacht werden. Selten ist das so deutlich wie zum Beispiel beim Mongolismus durch ein überzähliges Chromosom. Meist sind die mikroskopischen Veränderungen weniger ausgeprägt.
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Dennoch ist für ca. 600 menschliche Krankheiten die Korrelation zu einem veränderten Chromosom- oder Chromosomenabschnitt bekannt. Mit dem Lasermikrostrahl kann man präzise einen bestimmten Chromosomenabschnitt isolieren.
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Diese als Lasermikrodissektion bezeichnete Technik lässt sich besonders gut an gefärbten Chromosomen demonstrieren. Mithilfe der Methode können Erbkrankheiten effektiver erforscht werden. Da die genaue mikroskopische Lokalisierung im molekularen Maßstab noch eine Ungenauigkeit
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von einigen Millionen Buchstaben des genetischen Alphabets darstellt, ist die Lasermikrodissektion nur der erste Schritt der Untersuchung. Ein enzymatischer Abbau liefert Stücke von wenigen tausend Basenpaaren, die über die Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt und dann molekular-biologisch analysiert werden.
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Durch Fluoreszenz-Anfärbung können DNS-Moleküle lichtmikroskopisch sichtbar gemacht werden. Ähnlich wie bei den Chromosomen lassen sich einzelne Moleküle oder Stränge
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aus mehreren DNS-Molekülen präzise zerschneiden und so eine nochmals um zwei bis drei Größenordnungen verbesserte Ortsauflösung der Mikrodissektion erreichen.
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Noch ist dies reine Grundlagenforschung. Da aber in Zukunft mehr und mehr eine DNS-Einzelmolekülanalytik angestrebt wird, könnte die Lasermikrodissektion von Molekülen zu einer wertvollen Arbeitstechnik für dieses neu entstehende Forschungsgebiet werden.
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Die Anwendung des Lasers eröffnet eine völlig neue Dimension biologischer Mikrobearbeitung. Wohl kein anderes Werkzeug erlaubt es, im Inneren eines Objekts zu arbeiten, ohne dies zu öffnen. In der Zukunft wird diese Technik ihren Weg in viele Teilgebiete der Naturwissenschaften finden.