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Transgene Mice in Immunology

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Title
Transgene Mice in Immunology
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340
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CC Attribution - NonCommercial - NoDerivatives 4.0 International:
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At the age of 28, Georges Köhler co-invented the technique of producing monoclonal antibodies, which would become an indispensable research tool and dramatically improve the treatment of autoimmune diseases and cancer. At the age of 38, he shared the Nobel Prize in Physiology or Medicine for this achievement, together with his mentors César Milstein and Niels Jerne, being the German Federal Republic’s youngest Nobel Laureate ever. At the age of 48, he unexpectedly died from pneumonia, survived by his wife and three children. Listening to the both contemplative and self-assured voice of Georges Köhler in this first of two lectures he gave in Lindau, reveals the dimension of the loss, which his premature death meant not only to his family and friends, but to the entire immunological community. In 1974, as a post-doc, Köhler had joined the laboratory of the renowned immunologist César Milstein in Cambridge. His idea was to fuse a mutant cell line of mouse myeloma (a cancer of plasma cells) with mouse spleen cells that had been immunized with erythrocytes from sheep, and to incubate them in a specific medium, in which only fused cells could survive. Thereby he intended to create a hybridoma with the immortality of a tumour cell and the specific ability to produce antibodies against sheep erythrocytes. Both he and Milstein were sceptic about the prospects of success but decided to give it a try. Around Christmas of that year, Köhler’s first experiment was ready to be scrutinized. Halos had to emerge around the wells of the fused cells if they were producing antibodies. Köhler asked his wife Claudia to accompany him to see what had happened. "We went down into the basement of the institute, which has no windows," he remembered years later. "I looked at the first two plates. I saw these halos. That was fantastic. I shouted. I kissed my wife, I was all happy. It was the best result I could think of."[1] The importance of this discovery was initially overlooked by the community. When it gradually became apparent, Milstein was first given the sole credit for it and received prestigious awards such as the Sloan prize. Köhler did not grudge his mentor this recognition. In a memorandum written in 1981, however, he gently and gratefully reminded of his role in the invention of monoclonal antibodies: "I believe I was the driving force in it, but it is also true to say that I would not have thought about this problem in any other laboratory than César Milstein's and I wouldn't have been encouraged to do the experiment by anyone else but César Milstein.”[2] In this lecture, Köhler does not talk about his breakthrough. “I’m not going to explain how monoclonal antibodies are produced. It’s a technique, which is now well-known, and the story is, for me, over”, he says and continues – in German language as then requested by the organizers of the Lindau Nobel Laureate Meeting – to elaborate on the general importance of transgenic mice for immunological research. After a short introduction into immune biology, he explains how to produce and breed transgenic mice, and subsequently describes several applications and respective current research results. Georges Köhler’s invention had a revolutionary impact on medicine. Yet he had not much interest in its commercial exploitation. He was primarily driven by scientific curiosity. “I consider it more important to know things than to apply them”, he emphasizes at the end of this lecture. What an amazing statement for a man whose ingenuity has triggered within forty years after his invention the development of a still growing annual global market for monoclonal antibodies of annually 75 billion US-Dollars[3]. Joachim Pietzsch [1] quoted in Nicholas Wade. Georges Kohler, 48, Medicine Nobel Winner. Obituary, New York Times 4 March 1995 [2] Ibid. [3] Nature Milestones Antibodies, December 2016, p. S2
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Meeting/Interview
Transcript: German(auto-generated)
Thank you very much for your introduction. I'm not going to explain how monoclonal antibodies are produced. It's a technique which is now well known and the story is, for me, over.
Und ich sollte eigentlich Deutsch sprechen, fällt mir jetzt ein. Das bedeutet, dass Sie eine Art Übersetzung hören von dem, was Susumu Tonegawa auf Englisch gesagt hat. Einige der Bilder sind recht ähnlich. Wir kommen ja auch aus dem selben Institut und waren beide angeleitet von Nils Kajerne,
dem Direktor des Instituts in Basel. Was ich in diesem Vortrag machen möchte, ist Ihnen das Gefühl zu vermitteln, dass transgene Tiere, transgene Mäuse in diesem Fall,
für die immunologische Forschung ein wichtiges Hilfsmittel sind, das man nicht wegdenken kann. Und ich sage das deswegen in der Einleitung, weil es ja in Deutschland doch kritische Stimmen gibt über die Gentechnik und doppelt kritische Stimme, wenn es über transgene Tiere zu erzählen gibt.
Und ich hoffe, dass ich Sie überzeugen werde, dass man transgene Mäuse machen muss, um unsere Umwelt, unsere Welt besser zu verstehen. Das ist ein Zeichen. Ich weiß nicht, ob in Pandoras Box die überlangen Vorträge oder die Zeit drin war,
aber ich werde Sie anstellen. Im ersten Bild, und ich werde Ihnen eine kurze Einführung geben, über die Immunbiologie, dann die Technik kurz vorstellen und dann Anwendungen dieser Technik zeigen. Viele davon sind nicht in meinem Labor gemacht worden.
Ja, das ist komisch. Wir haben auch so einen Projektor, wo immer die Hälfte weg ist. Das ist ein Modell für die Maus. Und für die Mediziner ist es sicher einfacher zu erkennen. Das stellt das Immunsystem dar.
Nils Herne blickt bei diesem Bild, das ist übrigens aus einem seiner Reviews abfotografiert, zu sagen, das Immunsystem wiegt 1,5 Kilo. Das heißt, das ist ein Organ so schwer wie die Leber, es hat 10 auf 12 Zellen. Und die werden kontinuierlich in den Knochenmark produziert als Vorläuferzellen.
Sie wandern dann in den Blutstrom aus und gelangen, wenn sie T-Zellen sind, in den Thymus, bekommen da eine Education, werden ausgebildet und gehen dann weiter in die sekundären Lymphorgane, die Milz- oder die Lymphknoten. Im Knochenmark werden auch die B-Zellen gebildet und die wandern aus in Spleen und Lymphknoten.
Das Ganze ist noch mal zusammengefasst im nächsten Bild. Die Arten von Zellen, die entstehen im Knochenmark aus einer Stammzelle, entstehen die Blutzellen, die Sie alle kennen, Masszellen, Megakaryositten, Erythrozyten und so fort.
Und eventuell über eine gemeinsame Stammzelle die T-Linie, die dann in den Thymus einwandert und die B-Linie, die im Knochenmark greifen kann zu den surface, oberflächenpositiven Zellen, die Susumu Tonegawa schon vorgestellt hat. Vielleicht sollte ich hier gleich erklären, dass in der T-Zell-Linie es zwei unterschiedliche T-Zellen gibt.
Einmal die Helfer-T-Zelle, die über ein bestimmtes Antigen, das CD4-Antigen, und wir werden darüber noch etwas hören, charakterisiert ist, die helfen über Lymphokinproduktion nach ihrer eigenen Stimulierung den B-Zellen in Plasmazellen überzugehen und große Mengen von Antikörpern in Serum abzugeben.
Es gibt den zweiten Typ, davon haben Sie auch schon gehört, die Killer-T-Zellen, die erkennen Antigen, das auf Klasse 1-Molekülen präsentiert werden kann und halten virusinfizierte Zellen in Schach
oder nicht in Schach, sondern sie töten sie ab und das Virus kann sich nicht weiter fortpflanzen. Das nächste Bild zeigt Ihnen jetzt eine B-Zelle, wie von der DNS die RNS abgelesen wird, dass die Proteine gemacht werden, das Moleküle sitzt hier im endoplasmatischen Reticulum, wird heraus transportiert aus der Zelle und landet dann an der Oberfläche.
Das sieht sehr einfach aus, wir wissen aber, dass hier eine Menge Regulationsmöglichkeiten sind, wir wissen zum Beispiel, dass eine schwere Kette alleine nicht an die Oberfläche gelangen kann, sie braucht die leichte Kette, wir wissen warum sie die leichte Kette braucht,
weil sie nämlich sonst hier im endoplasmatischen Reticulum zurückgehalten wird von einem Molekül, das man Binding-Protein nennt, das heftet sich an eine ähnliche Stelle wie die leichte Kette und hält die schwere Kette hier zurück, das heißt, wir wissen schon einiges über diesen Mechanismus. In unserem Labor hat Michael Reed herausgefunden, dass das immer noch nicht reicht,
dass hier auch die leichte Kette produziert wird und dass die leichte Kette das Binding-Protein verdrängt und den Weg freigibt für die Oberflächenexpression von Immunoglobulin, sondern dass noch ein zweites Molekül, eine Heterodie mehr eine Rolle spielt und das ist
zusammengefasst im nächsten Bild, das ist ein Bild von Michael Reed aus unserem Labor, das ist eine schwere Kette, das ist die leichte Kette, von der ich gesagt habe, sie ist nötig, um das Bindungsprotein, das hier an die erste konstante Domäne bindet, zu verdrängen und er hat gezeigt, dass dieses Molekül dann immer noch nicht an die Oberfläche kommt, sondern dass es Hilfsmoleküle braucht, die hier mit Alpha und Beta gekennzeichnet sind
und erst dieser Komplex mit Alpha, Beta, schwere Kette und leichte Kette kann an der Oberfläche erscheinen und er hat auch gezeigt und das ist ziemlich einleuchtend, dieses IgM selbst, wenn es Antigen bindet, muss ja ein Signal in die Zelle geben,
das kann das offensichtlich nicht tun, denn es hat überhaupt keine zytoplasmatische Domäne und diese Korezeptoren haben diese zytoplasmatischen Domänen und wahrscheinlich geht das Signal über diese Korezeptoren in die Zelle hinein. Michael Reed hat dann auch gezeigt, dass diese Heterodimeere für andere Oberflächenrezeptoren der Immunoglobulin
Klassen für IgG und IgD ebenfalls notwendig sind und dass eventuell eine konstante Beta mit verschiedenen Alpha-Ketten die Expression der Immunoglobuline an der Oberfläche ermöglichen. Nächstes Bild, das muss Ihnen jetzt bekannt vorkommen, das ist ein Bild, das ich von Susumu Tonegawa habe. Sie wissen, dass die Variabilität, die in Immunoglobulinen
steckt, die ja von der schweren und leichten Kette zusammengenommen gemacht wird und dass sie über diese Rekombinationsvorgänge das korrekte Gen produzieren. Das nächste Bild,
jetzt sind wir bei der Technik angelenkt, wie macht man Transgenetiere? Hier hat man zwei, eine männliche und eine weibliche Maus, die setzt man am Tag Null zusammen, am nächsten Tag entnimmt man die gerade befruchteten Eier aus der Maus, das sind etwa 10 bis 20 aus dem
Verpaarung ansetzt, setzt man eine andere Verpaarung an, wo ein Weibchen mit einem sterilen Männchen zusammengesetzt wird, sodass es pseudo-pregnant ist. Man initiiert dann eine bestimmte DNS, die man vorher gereinigt hat, in den Pronucleus von dieser Zygote. Man initiiert
etwa 100 bis 1000 Moleküle in den Zellkern und transplantiert dann diese Zellen in einer Operation in die pseudo-schwangere Maus, die trägt dann die Embryonen aus. Bei den Embryonen wird dann nachgeschaut, ob sie die Fremd-DNS, die sie selbst bestimmt haben, tragen. Das wird gemacht, indem man kleine Schwanzspitzen abschneidet, die DNA extrahiert,
ein Sazanblatt laufen lässt und dann mit einer heißen Probe diesen Sazanblatt anschaut. Und manchmal, und zwar in einer Frequenz von ungefähr 5 Prozent der injizierten Zygoten, erhalten sie ein transgenes Tier, das die Fremdinformation zumindest in der
Schwanzspitze trägt. Dieses Tier wird dann weiter verpaart und wenn es diese Information an den Nachkommen weiter gibt, haben sie ein transgenes Tier gemacht. Das nächste Bild zeigt Ihnen das nochmal unter dem Mikroskop. Das ist eine Haltepippette. Hier ist die Zygote, hier ist die fein ausgezogene Pipette, in der die DNA-Moleküle
schwimmen und hier spritzen Sie die Fremdinformation ein. Das nächste Bild, da müssen Sie nicht erschrecken, das ist für mich da, das ist die Liste von Anwendungen der Technik, in welchen Experimenten man transgene Mäuse bisher verwendet hat, um etwas zu lernen.
Eines der ersten Experimente wurde in Australien gemacht. Da wurde ein Enhancer, das ist ein DNS-Element, das die Expression von Genen in B-Zellen lenkt, zusammen mit einem Onkogen in eine Maus eingeführt, mit der Idee, dass man eventuell Tumoren
bekommt und diese Maus entwickelt tatsächlich Tumoren in der B-Linie. Und hier kann auch genetische Veränderungen stattfinden müssen, damit ein solcher B-Zell-Tumor überhaupt entstehen kann. Denn auch in diesen transgenen Mäusen, die ein solches
Onkogen in B-Zellen exprimieren, entwickeln sich nur sehr wenige verschiedene Tumoren und wenn man diese Einzeltumoren anschaut, stellt man fest, sie brauchen noch zweite oder dritte Veränderungen in anderen Onkogenen. Das war eine der Anwendungen und man studiert das hier. Eine andere Anwendung war diesen selben Enhancer an ein Oberflächen, an das Gen von einem Oberflächenantigen zu
koppeln, das in T-Zellen exprimiert wird und von dem man nicht genau weiß, was es auf T-Zellen tut, das STI-1-Antigen. Und man stellt fest, wenn man das tut und transgene Mäuse macht, dass man nun plötzlich eine Hyperblasia von B-Zellen bekommt. Das heißt, dieses Antigen kann doch ein Signal vermitteln,
das Wachstum hervorruft. Eine andere Anwendung ist diese hier gewesen. Einige der Gruppen haben ein MHC Klasse 2 Antigen in Mäuse gebracht mit einem bestimmten Hintergedanken. Es gab lange Zeit Immune Response Genes, von denen man wusste, dass in bestimmten Mäusen da sind, in anderen nicht und dass sie
notwendig sind, um Antikörper-Response gegen bestimmte Antigene zu bekommen in Zuchtstemmen von Mäusen. Man wusste nie so genau, was sind die Immune Response Genes eigentlich. Und der Verdacht war, es sind vielleicht Klasse 2 Moleküle, die hier Antigen präsentieren können. Und in der Tat
hat man einen Maustamm genommen, der defekt war in einem Klasse 2 Gen und der auch defekt war in einer Immune Response, in einer Antikörper-Response gegen ein bestimmtes Antigen. Wenn man diese Maus transgenen machte für dieses Klasse 2 Antigen, war der Immune Response wieder hergestellt. Man hat also hier mit transgenen Mäusen den endgültigen Beweis geliefert, dass
die Präsentierungsantigene auch die Immune Response Genes waren. Eine andere Anwendung ist hier als Restriktion gekennzeichnet. Sie werden noch ein bisschen darüber hören. T-Zellen lernen im Thymus, ihre eigene Präsentierungsmoleküle zu unterscheiden. Und die Frage war, ist das
ein Lernen nur auf Mausmolekülen? Und das ist nicht der Fall. Man hat menschliche Klasse 1 Moleküle eingeführt, indem man transgene Mäuse gemacht hat. Und die Maus-T-Zellen lernen auch auf menschlichen Restriktionselementen, was sie zu sehen haben und was nicht.
Über Toleranz und somatische Mutation und allelen Ausschluss will ich etwas ausführlicher sprechen. Toleranz ist ein Problem, das die Immunologen schon seit jeher beschäftigt hat, als sie gemerkt haben, dass so ungeheuer viel Rezeptoren gemacht werden. Und das Problem war,
wie konnten diese Rezeptoren unterscheiden zwischen dem, was sie erkennen sollen, was von außen kommt und fremd ist, zu dem, was im Körper die eigenen Strukturen sind. Das Problem ist nochmal im nächsten Dir gezeigt. In so einem System, das so heterogen ist, und das sollen
jetzt die Rezeptoren darstellen, entweder auf T- oder B-Zellen, war es ganz schwer, experimentell in den Griff zu kriegen, zu fragen, ob nun diese Struktur durch Toleranz eliminiert worden ist oder nicht. Man konnte sie einfach nicht verfolgen in diesem Gemisch von verschiedenen Rezeptoren. Die Lösung war natürlich die transgene Maus, das nächste Bild. Das ist
viel einfacher zu studieren. Jetzt hat man eine Maus mit nur noch einen Rezeptor. Und diese Maus kann man studieren. Und das hat Harald von Böhmer in Basel gemacht, das nächste Bild. Das ist jetzt ein bisschen wissenschaftlicher. Hier hat er eine normale Maus mit verschiedenen Rezeptoren. Hier hat er die transgene Maus, die nur noch den einen Rezeptor macht,
den er vorgegeben hat. Und er kann diesen einen Rezeptor sauber bekommen, deswegen, weil es eine Mutation von Mäusen gibt, die Skip-Mäuse, die einen Defekt im Rearrangement ihrer Gene haben und so keine B- und keine T-Lymphozyten machen. Und wenn man diese nun transgenen
macht für einen T-Zellrezeptor, so hat das Harald von Böhmer und seine Gruppe gemacht, dann kann man den natürlich gut studieren. Und das nächste Bild gibt eine Zusammenfassung, was da gelernt worden ist. Aus den Experimenten, die Harald von Böhmer und seine Gruppe gemacht haben, hat man herausgefunden, dass es im Tymus erlernbar ist, was erkannt
werden soll. Und das ist ein bisschen so zu gut wie im wahren Leben. Eine Zelle, das hier ist eine T-Zelle, mit ihrem Rezeptor und den Hilfsmolekülen, das ist einmal CD8 und einmal CD4, die doppelt positiv ist, die gar keine Interaktion mit dem präsentierenden
Molekül hat. Die wird links liegen gelassen. Die hat mit dem ganzen System wenig zu tun. Eine andere Zelle, die zu stark interagiert, wird eliminiert. Das ist zu viel des Guten. Und die, die so gerade mittendrin sind, die mittlere Affinitäten zeigen, die werden belohnt und die werden selektioniert und können aus dem Tymus
herauskommen. Solche Rezeptoren haben dann gelernt, das eigene Resentationssystem zu kennen. Das ist also die Botschaft, die die transgenen Mäuse in den T-Zellen und Sagen, und das konnte man wirklich nur über transgene Mäuse lernen, dass ein bestimmter Rezeptor
eine ganz bestimmte Interaktion mit seinem Präsentationsmolekül haben muss, um selektioniert zu werden. Diese Zellen erkennen offensichtlich ein Peptid, das von Eigenantigenen kommt, und die werden eliminiert. Und man weiß nun, dass diese klonale Deletionshypothese richtig ist, dass diese Zellen, die Eigenstrukturen erkennen, im Tymus schon eliminiert werden. Das ist nur ein Teil. Der war
halt aber ein Großteil. Nächstes Bild zeigt nun ein weit weniger elegantes Experiment aus unserem eigenen Labor mit B-Zellen, und andere Labors haben bessere Experimente gemacht. Man sollte sich jetzt auch sein eigenes Material vorstellen. Dort haben wir
eine transgene Maus gemacht, welche eine schwere Kette für Immunoglobulin exprimiert, vom My-Typ, und zwar mit dem Bran-Anker, der hier angezeigt ist. Diese schwere Kette kam aus einem Hybridom mit einer Spezifität gegen eins der Hilfsmoleküle auf T-Zellen, und zwar eins der Hilfsmoleküle, die
auf Killerzellen sitzt. Also ein sehr spezieller Fall. Diese Maus exprimiert das Transgen in B-Zellen. Die endogenen leichten Ketten rearrangieren da und können mit dieser transgenen schweren Kette kombinieren und ergeben nun alle möglichen Kombinationen. Unter anderem müsste eigentlich auch eine Kombination drin sein, wo der entstehende Antikörper hier
das Originalantigen, nämlich das CD8-Molekül, erkennen kann. Und das wurde abgefragt, wie sieht das denn aus in den transgenen Mäusen, die das falsche Allel tragen, wo der Antikörper also nicht eine Struktur erkennen kann. Und man findet, wenn man Hybridome macht, dass eine in 250
B-Zellen diese Spezifität, die Anti-CD8-2-Spezifität machen kann. Wenn man aber in eine Maus geht, wo diese Spezifität selbst als Eigenantigen vorhanden ist, fehlen diese B-Zellen. Das heißt, es muss einen Mechanismus geben, der diese B-Zellen eliminiert. Das nächste Bild fasst das nochmal zusammen. Wenn wir
eine Spezifität haben, dass dieses CD8-2-Spezifität erkennen kann, wird diese Zelle eliminiert. Wir haben ein ähnliches Experiment gemacht mit einem sekretierten Antikörper, der nicht membranständig sein kann. Diese Zelle wird nicht eliminiert. Das heißt, es ist notwendig, dass der Rezeptor membranständig vorhanden
ist. Nächstes Bild. Das haben Sie schon mal gesehen von Susumu. Er soll mich daran erinnern, dass es somatische Mutationen, eine andere verrückte Erfindung des Immunsystems gibt. Und er hat Ihnen ja schon davon erzählt. Und Sie sehen hier ein Keimbahn-Gen und Sie sehen hier Varianten, die
sequenziert worden sind. Man stellt fest, dass die Mutationen nicht in der V-Region auftreten, nicht in der konstanten Region. Und eine der Fragen, die Ursula Staub über transgene Mäuse klären wollte, ist, passieren denn diese Mutationen nachdem das Gen rearrangiert ist? Oder können sie passieren oder passieren sie in dem Zeitpunkt, wo das Gen
rearrangiert? Das hätte natürlich den Vorteil, dass das System, der Mutator, der diese Mutationen setzt, schon am richtigen Ort wäre, nämlich an dem Ort, wo gerade rearrangiert wird. Wenn das nach dem rearrangieren passiert, muss der Mutator diesen Ort erst wieder finden können. Und sie hat ein schon rearrangiertes
Gen in eine Maus gebracht und hat gefragt, finde ich das somatische Mutationen? Und die Antwort war ja. Und das bedeutet, wir haben gelernt über das transgene Tier, dass die Mutationen ins schon rearrangierte Gen eingefügt werden und nicht während des rearrangierens eingefügt sind.
Das nächste Bild kommt zu einem Thema, das wir in Freiburg bearbeiten. Ein weiteres wenig verstandenes Phänomen in der Immunologie ist das, was man alle in Ausschluss nennt. Und das bedeutet, dass Antikörper oder T-Zellrezeptoren
in einer T- oder B-Zelle nur entweder vom väterlichen Typ, vom väterlichen Chromosom gemacht werden, jede Kette für sich, oder vom mütterlichen Chromosom, niemals von beidem. Und das ist eine ganz strenge Regel. Wenn man mit Immuntechniken nachschaut, findet man, dass eine B-Zelle nie, also nie heißt, weniger
als eins in tausend, einen gemischten Phänotyp von beiden Eltern zeigt. Dieses Phänomen hat man den alle in Ausschluss genannt. Und wir studieren den auch über transgene Mäuse. Und das führt zurück, oder das Phänomen möchte ich Ihnen hier nochmal darstellen. Das kommt Ihnen inzwischen schon bekannt vor.
Das sind die Genelemente, die rearrangiert werden müssen, um eine schwere Kette zu machen. Das die Genelemente, die VdJ-Reangement, das zweite Reangement, ein VdJ-Reangement.
Und wenn das ohne Fehler passiert ist, kann nun die schwere Kette gemacht werden. Wir wissen nun, dass die schwere Kette leichte Kettereangement induziert. Erst wenn die gemacht wird, fängt dieser Prozess an und dann hat man den Rezeptor an der Oberfläche. Es sieht nun so aus, wenn man Myelome studiert, nämlich
Tumorzellen, die selektioniert worden sind auf einen funktionstüchtigen Antikörper. Und man schaut nun das Stummeallel an. Dass das nicht benutzt worden ist, dann findet man für die schwere Kette in 60% der Allele, die haben ein vollständiges Reangement versucht, aber es war nicht aktiv. Das heißt, das erklärt ein Teil des Allelenausschlusses,
aber ein anderer Teil, etwa 40%, haben jetzt gar nicht versucht, ein vollständiges Reangement zu machen. Offensichtlich war es so, dass diese schwere Kette, die hier gemacht worden ist, zurückgemeldet hat. Du hast schon eine schwere Kette gemacht, versuch keine zweite. Und ähnliches gilt auch für die leichte Kette. Wenn man hier das stille Allel anschaut, das nicht benutzt wird,
dann findet man in 50% der Fällen ein Reangement, das aber nicht zu einem Produkt führt. Und in anderen 50% der Fälle wird es gar nicht erst versucht zu rearrangieren. Offensichtlich meldet auch hier die leichte Kette zurück. Du hast schon ein gutes Reangement gemacht, versuch kein zweites. Wie kann man das nun experimentell nachprüfen?
Das geht am einfachsten, indem man wieder eine transgene Maus macht, indem man ein schon vorrearrangiertes Gen vorgibt, das ist im nächsten Bild gezeigt. Das ist wieder eine schwere Kette-Gen mit einem bestimmten V-Teil. Und das ist eine My-Kette mit den Membranteilen. Das wurde indiziert in die Zygote.
Mehrere Mauslinien wurden gemacht. Und eine Analyse zeige ich im nächsten Bild. Das ist eine sogenannte Fax-Analyse, indem in einer Maschine zwei Fluoreszenzen aufgetragen werden können, die auf Zelloberflächen über Antikörper angebracht worden sind.
Und man sieht hier die normale Maus in der Milz. Und sie wurde angefärbt mit einem Anti-My-Reagenz, das den IgM-Rezepter an der Oberflächen erkennt, und mit einer anti-idiotypischen Reagenz, der spezifisch war für unser Immunglobulin. Und eine normale Maus hat dieses Protein nicht oder in zu geringen Mengen, aber die transgene Maus zeigt,
dass alle B-Zellen, die my-exprimieren, auch unseren Ig-Typ tragen und entsprechend das Transgen exprimieren. Man kann zeigen, und ich will da nicht darauf eingehen, dass T-Zellen normal ausschauen in so einer Maus, dass B-Zellen, die noch durch ein anderes Antigen definiert sind, ebenfalls normal ausschauen.
Also wir haben ungefähr dieselbe Menge B-Zellen noch. Und hier kommt wieder ein Unterschied zutage. B-Zellen haben normalerweise den my-Rezepter und den Delta-Rezepter an der Oberfläche. Und da sieht man, dass diese Zellen positiv sind für beide Marker. In der transgenen Maus ist nur ein Teil der Zellen positiv für my und Delta.
Ein größerer Teil hat nur das my. Und das zeigt schon, dass hier etwas schief läuft oder anders läuft mit der Entwicklung der B-Zellen. Und wenn man sich diese Maus nun genauer anschaut und Hybridome macht und diese Hybridome nun oder mithilfe der Hybridome diese Population Zelle für Zelle studieren kann, kommt das,
was im nächsten Bild zu sehen ist. Man macht diese Hybridome, und das sind einzelne Linien. Man inkorporiert Radioaktivität. Hier ist die Kontrolle und lässt dann SDS-Gele fahren, die Proteine nach ihrer Größe auftrennen. Und hier sehen Sie die Größe für die my-Bande, die 70.000, die Größe für die leichte Bande in der Kontrolle
bei 25.000. Und Sie stellen schon fest, dass es einen Unterschied gibt zwischen dem normalen Tier und der transgenen Maus. Die my-Bande ist relativ schwach nur. Und wie wir wissen, kommt die von dem transgenen. Und eine starke Bande, so wie in einer normalen Zelle, tritt gar nicht auf. Das heißt, irgendwie scheint
die endogene, schwere Ketteproduktion inibiert zu sein. Das kann man nochmal genauer studieren im nächsten Bild durch Southern Blots. Hier haben wir nochmal den Gen-Lokus von my aufgezeichnet. Den konstanten Teil, den J-Teil. Hier fangen die D-Elemente an. Das sind die Proben, die man verwenden kann.
Im nächsten Bild werden Sie einen Southern Blot sehen mit dieser Probe, damit Sie das besser verstehen. Das ist eine Probe, die 5 Strich ist von den J-Elementen. Das heißt, jedes Reangement von D nach J, was ja das erste Reangement im schweren Kettenlokus ist, würde diese Probe deletieren.
Das heißt, die würde nichts mehr angeben, wenn man mit der nachschaut, ob sie noch da ist. Ob das Äquivalent noch da ist. Der Southern Blot ist im nächsten Bild gezeigt. Und Sie können hier sehen, in der transgenen Maus finden Sie einige, die offensichtlich reangiert haben. Einige Zelllinien, aber andere haben noch überhaupt nicht reangiert. Das ist ein Bild, das man normalerweise
in den normalen B-Zellen nie findet. Das heißt, wir haben jetzt gelernt, oder ich passe das im nächsten Bild nochmal zusammen, die Gesamtdaten. Das sind also die Daten aus den Hybridomen, die wir bekommen haben. Und hier haben Sie die Mühmäuse, die wir analysiert haben.
Da sind 27 Allele analysiert, sechs sind überhaupt nicht reangiert gewesen. Und wenn man im Kontrolltier schaut, da haben wir 44 Allele angeschaut, da sind alle reangiert. Das heißt, wir haben gelernt, dass das Vorgeben eines schon reangierten Mühs zur Inhibition des eigenen Reangements führt.
Und das ist im nächsten Bild gezeigt. Da sollte ich noch sagen, wir haben das nicht nur für Müh gezeigt, sondern wir haben das auch für Delta gezeigt, und andere Leute haben das auch für Gamma gezeigt. Das heißt, es scheint nichts eine große Rolle zu spielen, wie dieser Rezeptor ausschaut. Hauptsache, ein Rezeptor ist da. Nächstes Bild, wir kommen zum Ende.
Das ist das, was wir gelernt haben über die transgenen Tiere in verschiedenen Labors, unter anderem auch unseren. Das kennen Sie inzwischen, das ist das Schema des Rearrangements. Wir wissen, dass wenn eine schwere Kette gemacht wird, und zwar nur eine schwere Kette vom Membrantyp, dann scheint die ein negatives Feedback-Signal zu geben auf den Rearrangementsprozess selbst.
Wir wissen, das sind Experimente von Ursula Staub gewesen, wenn wir eine leichte Kette vorgeben, dass sie ebenfalls einen Effekt hat, und zwar auf das Rearrangement des leichten Kettenlokus, aber nicht alleine. Offensichtlich ist diese Kombination von schwerer und leichter Kette ein Signal, das zurückmeldet,
ein guter Antikörper ist gemacht worden, fang nicht weiter an, zu rearrangiere nicht weiter. Und wir wissen von Arbeiten von Michael Reed, dass diese membranenständige schwere Kette offensichtlich auch ein Signal ist, das sagt, fang an, leichte Kette zu rearrangieren. Sie sehen also, dass der Rearrangierungsprozess intern durch die Produkte kontrolliert wird.
Ich hoffe, dass ich Ihnen mit diesen Beispielen aus unseren und anderen Labors doch vermitteln konnte, dass wir die transgenen Mäuse in der Immunologie, wo wir komplexe Systeme studieren, unbedingt als Hilfsmittel brauchen.
Ich sollte vielleicht noch darauf hinweisen, was ich auch ganz wichtig finde, dass ich nicht unbedingt weiß, ob wir mit dem Wissen, was Alela ausschließen nun bedeutet, irgendeine Anwendung verknüpfen können, und dass ich das auch nicht für so wichtig halte. Ich halte es für wichtiger, Dinge zu wissen, als sie anzuwenden. Dankeschön.