So, also wie beschrieben, haben wir jetzt mit der PCR die Möglichkeit, aus zum Beispiel

chromosomaler DNA unser entsprechendes Zielgen zu amplifizieren und mit Schnittstellen zu versehen, können dann das auch hier schneiden, so dass wir hier die Enten abschneiden und dann eben hier unsere DNA-Sequenz haben und haben hier unser geöffnetes Plasmid. Das heißt, wir können prinzipiell diese beiden DNA-Fragmente zusammenführen und können

dadurch ein neues Plasmid schaffen, wo eben jetzt unsere genetische Information drin ist. Also in unserem Fall sähe das Ganze dann so aus, als Restriktionsendonukleasen für unsere Clonierung haben wir gewählt NCO1 und XCO1, haben hier ein Stück entfernt

aus unserem PET 28a Plasmid und haben hier eben unser eGFP, wo wir die Enten NCO1 und XCO1 gemacht haben und das dann auch verdaut haben. Man kann das natürlich zusammenlagern, aber wir haben immer noch Einzelstrangbrüche an den Stellen, wo sich eben die Fragmente überlappen und das würden die Zellen

an sich nicht akzeptieren und deswegen müssen wir irgendwie diese Einzelstrangbrüche verschließen und das machen wir mit einem Enzym, das sich DNA-Ligase nennt. An diesem Reaktionsschema hier ist nun mal die Funktion der Ligase exemplarisch erklärt und zwar haben wir hier das Enzym, was über die Aminseitenkette von einem Lesinrest

mit ATP reagieren kann und zwar greift es an den Phosphat von AMP an und spaltet Pyrophosphat ab und dadurch erhalten wir eben diese aktivierte Form der Ligase, die nun wiederum angegriffen wird von einem 5-Strich Phosphatende, die sich das AMP

schnappt und wieder die Ligase an sich freisetzt. Wir kriegen also hier eine aktivierte Phosphatspezies, die von dem 3-Strich-OH-Ende angegriffen werden kann und eben das AMP abspaltet und so kriegen wir eben durch eine relativ simple Folge von Reaktionen das Schließen unseres Einzelstrangbruchs

und so kriegen wir aus, wie wir eben gezeigt haben, zwei komplementären DNA-Fragmenten, eine zusammengeschlossenes oder eine einzelne DNA-Einheit unserer Plasmid mit der genetischen Information, die wir drin haben wollten, drin, in unserem Fall, die für das GFP.

So, wenn man jetzt, wie wir beschrieben haben, ein neues Plasmid hergestellt hat, also in unserem Fall haben wir hier den PET28A-Vektor und hier das Gen für das EGFP, dann muss man das natürlich noch irgendwie in die Zellen einbringen, damit die Bakterien, die Plasmide zum einen vervielfältigen können, zum anderen, dass sie für uns auch natürlich die Gene exprimieren können und für unsere Proteine kriegen und dazu gibt es

verschiedene Methoden und die, die wir am häufigsten verwenden, ist die sogenannte Elektroporation. Bei der Elektroporation werden speziell vorbereitete Zellen, man nennt sie dann Elektrokompetent, mit eben der Lösung, wo dieses Plasmid drin enthalten ist, vermischt in eine E-Küvette gefüllt und das eben in einen Elektroporator gestellt.

Und was dieser Elektroporator macht, ist, dass er einfach einen kurzen Strompuls auslöst. Durch diesen Strompuls werden die positiv geladenen Metallionen aus den Membranen der Zellen gerissen und die Membranen werden, bis die Zellen das reparieren, also kurzzeitig instabil und permeabel für DNA. Und so kann eben die DNA da drin

eintreten und wir erhalten unsere Zellen, die diese Plasmide enthalten. Und wie bereits erklärt, müssen wir natürlich einen Selektionsdruck schaffen, damit diese Plasmide erhalten werden und das ist eben über diese Resistenz gegen Kanamizin. Da die Plasmide natürlich gerade erst in die Zellen eingebracht werden, ist die Resistenz

noch nicht vorhanden, sondern wir müssen den Zellen erstmal eine gute Stunde bei 37 Grad geben, um diese Enzyme zu exprimieren und diese Resistenz zu entwickeln. In dieser Zeitspanne, die ist noch zu kurz, dass die Zellen die Plasmide wieder rauswerfen würden, deswegen ist das kein Problem. Und nach dieser Stunde streichen wir diese Zellen

eben auf Aga-Platten aus, also wir Festmedium mit Aga vermischt haben, damit das ein schönes festes Medium gibt und haben aber auch gleichzeitig eben unser Kanamizin oder ein anderes Antibiotikum darin, was den Selektionsdruck schafft. Und nachdem wir das dann so ausgestrichen haben, inkubieren wir das über Nacht bei 37 Grad, kriegen wir wenn alles

geklappt haben, Platten wo dann einige Bakterienkolonien gewachsen sind. Das sind dann alles Kolone von einer einzelnen Zelle, die dieses Plasmid hat. Die vermehren sich, vermehren sich, vermehren sich und bilden irgendwann solche große Zellhaufen, dass man sie mit bloßem Auge sehen kann. Jetzt müssen wir natürlich überprüfen, ob da auch die richtigen Plasmide drin sind und dass es keine Verunreinigung war

oder eine Kontamination mit anderen Zellen. Und das tut man, indem man diese Plasmide präpariert. Dazu pickt man eine Kolonie, also man sticht mit einer Eppendorf-Pipettenspitze da rein und überführt das in eine Flüssigkultur. Die inkubiert man dann über Nacht, also die hat auch das Antibiotikum drin, sodass das Plasmid nicht verloren geht, inkubiert das Ganze über Nacht und das Ganze deswegen auch über Nachtkulturen und

fügt dann die Zellen runter, hat dann ein kleines Zell-Palette und aus dem Zell-Palette kann man dann eben die Plasmide präparieren. Dazu wird das Ganze erstmal in einem Puffer resuspendiert, wird mit einem anderen Puffer versetzt, der stark basisch ist. Unter diesen stark basischen Bedingungen werden dann die Zellen realisiert, also sie gehen kaputt und

setzen ihre Bestandteile frei. Diese Inkubation mit diesem Puffer darf nicht zu lange erfolgen, da unter diesen alkalischen Bedingungen auch irgendwann unsere DNA angegriffen werden würde und deswegen geben wir dann nach fünf Minuten Inkubation einen anderen Puffer dazu, der das Ganze neutralisiert und gleichzeitig etwas enthält, um andere Zellbestandteile wie Proteine oder Trümmer der Zellmembran auszufädeln.

Das heißt, wir zentrifugieren das Ganze ab, haben dann unsere Zelltrümmer und andere Bestandteile, die wir abtrennen wollen und im Überstand unsere DNA-Lösung. Die pipettieren wir ab, versetzen sie mit Isopropanol. Unter den Bedingungen fällt dann die DNA aus. Wir können sie abzentrifugieren, die restliche Lösung wegschütten und haben dann

ebenso unser Plasmid präparieren können. Und jetzt müssen wir noch überprüfen, ob das auch das richtige Plasmid ist. Und dazu nimmt man eine Methode, das nennt sich Testverdau. Ein solcher Testverdau ist einfach ein Verdau, den man so wählt, dass unser Plasmid in bestimmte große Fragmente geteilt wird. Man könnte zum Beispiel hier in

zwei kleinen und einen großen das Teil und das ist dann spezifisch für ein solches Plasmid. Da ist ja nur an diesen speziellen Stellen die speziellen Stitzstellen für diese Restriktionsendonukleasen, die man sich ausgesucht hat, besitzt. Man inkubiert das also mit diesen Restriktionsendonukleasen, also beziehungsweise eine kleine Probe davon und trägt das dann auf eine agarose Gel auf. Und damit wir das

auf diese Gele auftragen können, müssen wir unsere DNA-Lösung mit einem sogenannten Probenpuffer versetzen. Und der ist halt so ein recht tiefblauer Puffer, weil da sind Farbstoffe drin und der hat auch eine recht hohe Dichte, damit das schön in diese Taschen von den

Stiftungen und der Stiftung. Und dann wird eben die DNA in Richtung von dem positiven Pol gezogen und durch dieses Gel erfolgt eine Trennung nach der Größe der DNA-Fragmente. Wenn man jetzt dem ganzen noch einen Marker dazu gibt, also eine Mischung von DNA-Fragmenten

bestimmter Länge, dann kann man dann auch sehen, wie groß die Fragmente sind, die man sieht und kann so überprüfen, ob das richtige Restriktionsmuster vorhanden ist und damit ob das die richtige Plasmid enthalten hat. Und die Farbstoffe sind darin, damit man mit bloßem Auge verfolgen kann, wie lang das Gel oder wie weit das Gel schon gelaufen ist. Weil die DNA kann

man da noch nicht sehen. Damit man die DNA sehen kann, gibt man dem Gel einen Stoff zu, den er sich Etidium Promit nennt. Und das ist ein aromatisches, flaches System, was sich zwischen die DNA, also zwischen die Basenpaare einlagern kann. Man nennt das Ganze Interkalieren. Und das Besondere an diesem Stoff ist, er fluoresziert. Und diese Fluoreszenz

wird um einiges stärker, wenn er eben in DNA interkaliert. Und dann kann man eben einfach dieses Gel nehmen und sich unter UV-Licht angucken. Und dann sieht man halt überall, wo größere Mengen DNA vorkommen, als fluoreszierende Banden auf diesem Gel. Und so kann man eben überprüfen, ob das Plasmid das richtige ist. Sollte dieser Restriktionsverdau positiv sein, dann ist der nächste Schritt, dass man einen

Teil der Plasmidlösung nimmt und zum Sequenzieren schickt. Und das macht dann eine Firma für uns. Und wenn sich dann DNA wirklich zeigt, dass wirklich die Sequenz genau so ist, wie wir sie haben wollen, dann können wir das weiter verwenden und können mit dem restlichen Plasmidlösung, die wir da haben, die wieder erneut in Zellen reinbringen, in den wir dann eben unserer GFP exprimieren.